2010/2011 Учебный год

1.Дыхание растений и его особенности.

Дыхание – разрушение органических веществ при участии кислорода воздуха, в результате образуется СО₂ и Н₂О. Энергия используется на образование АТФ. То что дыхание проходит в 2 стадии определил Паладин.

1. С₆Н₁₂О₆ + 6Н₂О + 12R → 6 СО₂ + 12RH_{2 ,} 12 R – дыхательный пигмент, 12 RН2 – дыхательный хромоген.

2. 12RH₂ + 6О₂ → 12R + 12 Н₂О

итого

С₆Н₁₂О₆ + 6О₂ → 6 Н₂О + 6СО₂

1.Первая фаза – анаэробная, а вторая – аэробная.

2.В дыхание участвуют вода и пигменты

3.Окисление в результате дегидрирования

Часть энергии запасается в связях АТФ, а часть восстанавливает коферменты (доноры Н⁺). Восстановление коферментов идет с образованием воды и одновременным синтезом АТФ. Энергия должна освобождаться малыми дозами и использоваться эффективно (иначе она рассеется в виде тепла).

Отличительные особенности дыхания растений.

1.Окисляется экзогенный НАДН (НАДФН), который поступает из цитоплазмы с помощью НАД(Ф)Н дегидрогеназы.

2.На внутренней мембране наряду с цитохромным переносом электронов по ЭТЦ, функционирует цианидный путь (устойчивый к действию цианидов), т.к. есть устойчивая цианидоксидаза в растительных стенках.

3.Митохондрии растительных клеток содержат малит-энзим, который катализирует окислительное декарбоксилирование малата с образованием пирувата, далее малат окисляется в цикле Кребса.

2.Генная инженерия. Методы клонирования генов. Векторные системы, использующиеся при клонировании генов.

Генная инженерия — раздел молек. генетики св. с целенаправленным созданием новых молекул ДНК, способных размножаться в клетке-хозяине и осущ. контроль за синтезом необх. метаболитов кл. Возникнув на стыке химии НК и генетики м/о, она занимается расшифровкой структуры генов, их синтезом и клонированием, вставкой выделенных из кл. живых организмов / вновь синтез-ных генов в кл. раст. и жив. с целью направленного изменения их наследственных свойств.

ВЕКТОРЫ для м/о: из плазмидной ДНК (pBR322) и из ДНК фагов (λ). На осн. ssДНК фагов: F1, F2, fd. Исп. для опр. последовательности нуклеотидов. В цикле их разв. обр. ds – формы, потом → ss.

Грам «+» (Bacillus) обл. собственными плазмидами, кот. не несут селективные маркеры. Поэтому исп. плазмиды Stafillococus, кот. несут устойчивость к а/б и экспрессируются в бациллах (pUB110, pAC194). Они мультикопийны, небольшого размера, индуцируются при добавлении а/б.

КЛАССИФИКАЦИЯ ВЕКТОРОВ:

• по целевому назначению – для амплификации гена, для секвенирования, для экспрессии гетерологичной ДНК и секретирующие (грам «+») – к Б пришивается сигнальная последоват-сть.

• прямой и непрямой селекции:

- прямая - вставка в ген приводит к его инактивации (подавл. способность с синтезу бактерицинов)

- непрямая – обладает новыми признаками (а/б устойчивость, изм. морфология).

ВЕКТОРЫ для эукариот: на основе ДНК хлоропластов, митохондрий и вирусной.

Для животных вектора на осн. вируса SV40. Дефектный вирусный геном внедряется в геном клетки и способен только продуцировать вирусные белки, в то время как сами вирусы не продуцируются, вследствие нарушенной репликативной функции. Однако если в трансформированную таким образом клетку внести рекомбинантную ДНК вируса SV-40 с ненарушенной репликативной системой, содержащую к тому же вставку из интересуемой ДНК, то начнется репликация рекомбинантных вирусных плазмид в больших количествах. Они, оставаясь внехромосомальными, накапливаются в количествах до 100 тысяч на клетку, одновременно происходит транскрипция интересуемой ДНК-вставки с образованием мРНК и синтез целевого белка в результате трансляции.

Для растений – Ti-плазмиды. От Agr. tum, специфический Т-участок кот. сп. вкл. в кл. двудольных раст. и внедряться в их Я ДНК, что ведет к обр. специф. опухолей (галлов); содержит гены, контрол. синтез редких а.к. (опинов) – октопина, нопалина, агропина.

Для насекомых – бакуловирусы + ген полиэдрина (бакмиды для E. coli и насекомых).

ВЕКТОРЫ для дрожжей: на основе бактериальной и дрожжевой плазмид (2 микронная).

Рекомбинантная ДНК – любой вектор со вставкой.

Способы выделения гетерологичной ДНК.

1) «шот-ган» - ДНК делят на фрагменты (рестриктазы, физ. возд.), затем соед. с вектором.

2) хим. синтез ДНК – нужно знать конечный продукт, кот. д.б. небольших размеров.

3) получение кДНК – так м. получить ДНК опр. органов и тк.; м. получить ДНК опр. стадии ЖЦ.

Соединение вектора и ДНК.

Соед. комплементарных концов требует наличия АТФ, ионов Mg. Приемы:

1. с помощью линкеров и адаптеров – исск. синтез. мол. ДНК, кот. им. сайты для 1 / неск. рестриктаз.

2. коннекторов – послед-ти ДНК, комплементарные др. др. (поли Т –вектор, полиА – гетеролог. ДНК).

Реципиентная кл. выполняет 2 функции:

1) хозяин для рекомбинантной ДНК;

2) хозяин для наработки и получения целевого продукта.