Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
метод ІҮ сем 11-12 рус .doc
Скачиваний:
6
Добавлен:
01.07.2025
Размер:
702 Кб
Скачать
☆

Метод количественного определения содержания общего и прямого билирубина в сыворотке крови

Билирубин «ДДС»

Принцип метода

Прямой (конъюгированный) билирубин взаимодействует с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием окрашенного азосоединения, интенсивность окраски которого измеряется фотометрически при длине волны 546 нм.

Общий билирубин (прямой и неконъюгированный) в присутствии диазотированного дихлоранилина вступает в реакцию азосочетания и образует окрашенный в красный цвет комплекс азокрасителя в кислом растворе, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна содержанию билирубина в пробе и измеряется фотометрически при длине волны 546 нм.

Подготовка к анализу:

а) Приготовление рабочего реагента для определения общего билирубина. Смешать в колбе конической вместимостью 200 мл необходимые объемы реагентов 1 и 2 в соотношении 100:1, полученный реагент выдержать в темном месте при температуре +18-25қС не менее 15 мин. Тщательно закрыть флаконы с реагентами 1 и 2 непосредственно после каждого использования.

Рабочий реагент можно хранить при температуре +2-8ºС не более трех недель или при комнатной температуре – не более 10 суток.

б) Приготовление калибратора. Во флакон с реагентом 4 внести точно 1,0 мл дистиллированной воды. Содержимое флакона растворить при осторожном перемешивании при комнатной температуре (+18-25ºС). Полученный калибратор содержит «а» мкмоль/л билирубина. Концентрация билирубина «а» мкмоль/л в калибраторе указана на этикетке флакона реагента.

Калибратор можно хранить в темном месте при температуре +2-8ºС не более 1 суток.

Реагенты 2 и 3 для определения прямого билирубина готовы к использованию.

Проведение анализа Определение общего билирубина

Компоненты реакционной смеси отбирать в количествах, указанных в таблице 1.

Отмерить (мл)

Опытная проба

Контрольная (холостая) проба

Калибровочная проба

Калибровочная (холостая) проба

Рабочий реагент

Реагент 1

Сыворотка крови

Калибратор

1,0

-

0,1

-

-

1,0

0,1

-

1,0

-

-

0,1

-

1,0

-

0,1

Пробы перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут. Измерить оптическую плотность опытной пробы против контрольной (холостой) пробы и оптическую плотность калибровочной пробы против калибровочной (холостой) пробы в кювете с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 546 нм. Окраска стабильна в течение 30 мин.

Определить по калибратору билирубина фактор пересчета (F) оптической плотности в мкмоль/л по формуле:

F= «а»

Екал

где: Екал – оптическая плотность калибровочной пробы, ед. опт плотн.;

«а» - концентрация билирубина в калибраторе, мкмоль/л.

Определение прямого билирубина

Отмерить (мл) Опытная проба Контрольная (холостая) проба

Реагент 3 1,00 1,00

Реагент 2 0,02 -

Вода дистиллированная - 0,02

Сыворотка крови 0,10 0,10

Пробы перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 3 минут (точно). Измерить оптическую плотность опытной пробы в кювете 10 мм при длине волны 546 нм против контрольной (холостой) пробы.