Определение содержания общего белка в сыворотке крови биуретовым методом

Принцип. Белки сыворотки с сернокислой медью в щелочной среде образуют комплексное соединение фиолетового цвета (биуретовая реакция). Интенсивность окрашивания раствора находится в прямой зависимости от концентрации в нем белка и измеряется в единицах оптической плотности с помощью специального прибора-фотоэлектрического колориметра (ФЭК-М). На рис. 67 приведена схема устройства ФЭК-М.

Порядок измерения оптической плотности на фотоэлектроколори-метре. Прибор ФЭК-М состоит из стабилизатора напряжения 2, обеспечивающего постоянство накала источника света (лампы), и собственно фотоэлектроколориметра (рис.68).

Ход определения. В пробирку отмеривают 0,1мл сыворотки крови и 5мл биуретового реактива, хорошо смешивают, избегая образования пены.

Через 30 минут определяют оптическую плотность раствора на фотоэлектроколориметре против контроля, содержащего вместо сыворотки 0,1мл 0,9% раствора хлористого натра. Фильтр зеленый, кюветы с расстоянием между рабочими гранями 10мм.

Расчет ведется по так называемой калибровочной кривой. Это выраженная в виде графика зависимость между оптической плотностью исследуемого раствора и концентрацией белка в нем. Для построения калибровочной кривой готовят несколько растворов белка альбумина известной концентрации, как указано в таблице, проделывают цветную реакцию с каждым из них и определяют оптическую плотность на ФЭК-М. Стандартным раствором служит 10% раствор кристаллического альбумина на 0,9% растворе хлористого натрия.

Кол-во стандартного раствора белка в мл	0,9% раствор хлористого натрия в мл	Концентрация белка в %	Оптическая плотность (экстинкция)
0,4 0,6 0,8 1,0	0,6 0,4 0,2 —	4 6 8 10

Выявление белков (проявление электрофореграмм) проводят путем окраски электрофореграмм каким-либо красителем. Раствор одного из красителей (бромфеноловый синий с сернокислым цинком) готовят растворением 0,1г бромфенолового синего и 50г сернокислого цинка в 1 литре 5% уксусной кислоты.

Электрофореграммы погружают в краситель, налитый в плоские фотографические кюветы, на 8-20 часов. (Нельзя накладывать электрофореграммы друг на друга.) Затем полосы переносят в 2 % раствор уксусной кислоты и, меняя раствор 4-5 раз, отмывают избыток красителя. Проявленные электрофореграммы высушивают на воздухе. На них отчетливо видны в виде окрашенных полос, имеющих характерное расположение, основные фракции белков сыворотки крови.

Количественное определение белковых фракций

Определение соотношения отдельных фракций белка производят путем извлечения краски из бумаги и колориметрического определения ее количества

Окрашенную электрофореграмму разрезают на отдельные куски, соответствующие белковым фракциям, и каждый из них помещают в отдельную пробирку. К альбуминовой фракции добавляют 30мл, а к глобулиновым -по 10мл 0,1н. раствора едкого натра. Через 30 минут полоски извлекают из пробирок, а элюат фотометрируют на ФЭК-М (технику см. в работе 274) против экстракта из участка электрофореграммы, не содержащего белка.

Расчет. Величину экстинкции для альбуминовой фракции умножают на 3 и к полученной цифре прибавляют величины экстинкции остальных проб. Сумму экстинкций принимают за 100 и вычисляют процент экстинкции каждой из проб по отношению к этой сумме.

Исходя из того, что количество белка пропорционально количеству связавшегося с ним красителя, можно считать, что соотношение экстинкций элюата различных участков фореграммы отражает соотношение белковых фракций в сыворотке крови.