3.2. Иммобилизованные ферменты

Широкие перспективы открылись перед инженерной энзимологией в ре-

зультате создания нового типа биоорганических катализаторов, так назы-

ваемых иммобилизованных ферментов. Термин «иммобилизованные фер-

менты» узаконен сравнительно недавно, в 1974 г. Сандэремом и Реем, хотя

еще в 1916 г. Нельсон и Гриффи показали, что инвертаза, адсорбированная

на угле или алюмогеле, сохраняет свою каталитическую активность. Однако

начало целенаправленных исследований, ориентированных на создание та-

кого рода стабилизированных ферментных катализаторов, относится к сере-

дине XX века, при этом широкий фронт работ и ощутимые успехи достиг-

нуты в последние 20–25 лет. Иммобилизация – это процесс прикрепления

ферментов к поверхности природных или синтетических материалов, вклю-

чение их в полимерные материалы, полые волокна и мембранные капсулы,

поперечная химическая сшивка. Иммобилизацию также можно характери-

зовать как физическое разделение катализатора и растворителя, в ходе кото-

рого молекулы субстрата и продукта легко обмениваются между фазами.

Разделение может быть достигнуто адсорбционным или ковалентным свя-

зыванием фермента с нерастворимыми носителями, либо связыванием от-

дельных молекул фермента с образованием агрегатов. При иммобилизации

ферментов происходит стабилизация каталитической активности, так как

этот процесс препятствует денатурации белков. Иммобилизованный фер-

мент, имеющий ограниченную возможность для конформационных пере-

строек, быстрее растворимого находит кратчайший путь к функционально

активной конформации. Иммобилизованные ферменты приобретают, поми-

мо стабильности, отдельные свойства, не характерные для их свободного

состояния, например, возможность функционировать в неводной среде, бо-

лее широкие зоны оптимума по температуре и рН. По образному выраже-

106

нию А. М. Егорова (1987) «Иммобилизованные ферменты как гребцы-

невольники на галерах, прикованные каждый к своей скамье, пространст-

венно разобщены на носителе. Это означает резкое затруднение межмоле-

кулярных взаимодействий типа агрегации, которые могут вызвать инакти-

вацию фермента». При этом фермент из разряда гомогенных катализаторов

переходит в разряд гетерогенных, то есть находится в фазе, не связанной ни

с исходным субстратом, ни с образуемым продуктом. Это позволяет органи-

зовывать на базе иммобилизованных ферментов различные более эффек-

тивные биотехнологические процессы многократного периодического, а

также непрерывного действия с использованием принципа взаимодействия

подвижной и неподвижной фаз.

Длительность сохранения каталитической активности и ряд свойств

ферментов определяются правильностью выбора носителя, метода и

условий проведения иммобилизации. Существует несколько принципи-

ально различных подходов, позволяющих связать фермент с носителем:

адсорбционные методы и методы химического связывания на поверхно-

сти, методы механического включения или захвата, методы химическо-

го присоединения (рис. 3.2).

Методы иммобилизации путем адсорбции основаны на фиксировании

фермента на поверхности различных материалов – неорганических (сили-

кагель, пористое стекло, керамика, песок, обожженная глина, гидроокиси

титана, циркония, железа) и органических (хитин, целлюлоза, полиэтилен,

ионообменные смолы, вспененная резина, полиуретан с ячеистой структу-

рой). Насколько разнообразны материалы, применяемые для адсорбции

ферментов, настолько различны механизмы и прочность связывания фер-

мента с носителем. Характеризуя эти связи, можно говорить о широком

их спектре, от простого обрастания носителя до образования полярных,

ионных и ковалентных связей. Адсорбция – это самый простой метод им-

A

B Г

Д

Б

Рис. 3.2. Основные методы иммобилизации ферментов.

А – абсорбция на крупнопористом носителе; Б – ковалентное связывание; В – адсорбция;

Г – поперечная сшивка; Д – включение в гель.

107

мобилизации ферментов на поверхности нерастворимых носителей.

Процедура иммобилизации состоит в смешивании в определенных ус-

ловиях фермента с носителем и инкубации смеси. Затем при помощи

фильтрования и центрифугирования проводят отделение нерастворимого

компонента смеси от растворимого. В процессе адсорбции фермента на

носителе при их взаимодействии возникают солевые связи, а также другие

слабые взаимодействия (водородные, ван-дер-ваальсовы). Адсорбция –

мягкий метод иммобилизации, при котором влияние носителя на актив-

ность фермента минимально, поэтому, как правило, ферменты хорошо

сохраняют активность. Недостаток данного метода – непрочность связей.

Поэтому при незначительном изменении условий среды (рН, температу-

ры, ионной силы, концентрации продукта) возможна десорбция фермента

с поверхности носителя. Более прочными являются связи, основанные на

ионном взаимодействии, когда адсорбция поддерживается при определен-

ных значениях рН и ионной силе омывающего фермент раствора.

Методы химического связывания имеют долгую историю и реализу-

ются в различных модификациях. Практически все функциональные

группы белков могут быть использованы для связывания катализатора с

носителем. Широкое применение нашли реакции, ведущие в присутствии

водоотнимающего агента к образованию пептидных связей между амино-

группами фермента и карбоксильными группами носителя или, наоборот,

– между карбоксильными группами фермента и аминогруппами носителя.

В качестве водоотнимающего агента используют дициклогексилкарбо-

диимид, сшивающим агентом может служить бромциан. Возможно

проведение сшивки без участия сшивающих агентов. Перспективным

подходом в развитии данного метода является использование в качестве

носителя привитых полимеров. Прививая к поверхности полимерного

материала боковые ветви, можно регулировать его свойства и влиять на

реакционную способность за счет создания на поверхности носителя

микросооружений, оптимальных для стабильного функционирования

биокатализатора. Пример такого подхода – применение полиэтилена с

привитыми поливиниловым спиртом или полиакриловой кислотой. С

целью снижения диффузионных затруднений между субстратом и

ферментом, а также для облегчения оттока образующихся продуктов, при

иммобилизации можно выводить фермент из микросооружения молекулы

носителя. Фермент присоединяют к поверхности носителя через

некоторую, определенной длины, химическую последовательность, так

называемый спейсер («поясок»).

Иммобилизация путем химической сшивки фермента с носителем ха-

рактеризуется высокой эффективностью и прочностью связи. Для предот-

вращения снижения каталитической активности фермента место сшивки

удаляют от активного центра катализатора и присоединение проводят не

по белковой части молекулы, а по углеводной.

108

Одним из наиболее эффективных методов иммобилизации с образовани-

ем химических связей считают образование ковалентных связей между мо-

лекулой носителя и катализатором. Как правило, для ковалентного присое-

динения носитель нужно предварительно активировать (активацию аффин-

ных носителей проводят, например, бромцианом). Более простым, не тре-

бующим предварительной модификации носителя и быстрым методом им-

мобилизации в простых условиях является металлохелатный метод. Он за-

ключается в иммобилизации ферментов на носителях из полимеров гидро-

ксидов металлов (титана, циркония, олова, железа). Гидроксильные группы

вытесняются из координационной сферы того или иного металла функцио-

нальными группами фермента, в результате между носителем и ферментом

возникает координационная или ковалентная связь. Успех метода определя-

ется рядом условий: в молекуле фермента должны присутствовать группы,

играющие роль лигандов и способные стерически контактировать с атомами

титана; данные группы должны быть удалены от активного центра. Метод

применяют в различных вариантах, с использованием органических и неор-

ганических носителей, включая ионообменные носители. Природа комплек-

са может существенно влиять на активность и операционную стабильность

иммобилизованного фермента (табл. 3.4–3.5).

Сравнительно новой разновидностью металлохелатного метода явля-

ется иммобилизация ферментов на основе гидроксидов переходных ме-

таллов, в основном титана и циркония. Молекулы фермента закрепляются

на поверхности носителя путем образования хелатов. Для реализации

данного метода, помимо фермента, необходимо наличие только одного

реагента, собственно гидроксида металла.

Т а б л и ц а 3 .4

Влияние метода иммобилизации с использованием комплекса TiCl4 на активность глю-

козоамилазы (по Дж. Вудворду, 1988)

Комплекс, использованный для активации Активность фермента, ед./г

TiCl4 – акриламид 1.03

TiCl4 – мочевина 0.36

TiCl4 – лимонная кислота 0.41

NiCl4 – лактоза 0.48

Т а б л и ц а 3 .5

Операционная стабильность ферментов, иммобилизованных на носителях,

активированных титаном (IV) (по Дж. Вудворду, 1988)

Фермент Носитель Температура, °С Время полуинактивации

Глюкоамилаза Роговая обманка

пористое стекло

50

45

10 ч.

1 ч.

Инвертаза Роговая обманка

пористое стекло

25

18

54 сут.

8 сут.

109

Недостатком методов иммобилизации на основе физической адсорб-

ции или ковалентного присоединения является необходимость использо-

вания достаточно больших количеств катализатора. Более того, химиче-

ская модификация, которой подвергаются ферменты в процессе иммоби-

лизации. Может существенно снижать их каталитическую активность.

Избежать этого можно при использовании методов иммобилизации фер-

ментов путем включения в полимерную структуру.

В качестве полимерных носителей применяют природные и синтетиче-

ские материалы (альгинат, желатину, каррагинан, коллаген, хитин, целлю-

лозу, полиакриламид, фоточувствительные полимеры). Раствор фермента

смешивают с раствором мономеров носителя. Далее создают условия для

процесса полимеризации, в ходе которого происходит механическое

включение фермента в структуру носителя. Важным моментом является

равномерность распределения молекул фермента в объеме носителя и од-

нородность получаемых агрегатов. Техника включения зависит от приро-

ды и свойств используемого материала, образуемые при этом биосистемы

имеют вид гранул, волокон, полимерных сеток, пленок и т.п.

Иммобилизация в полиакриламидный гель (ПААГ), который наиболее

часто используется для этих целей, заключается во внесении раствора

фермента в раствор мономера (N, N1-метилендиакриламида). Далее в по-

добранных условиях быстро формируется гель в виде блока. Монолитный

гель измельчают, придавая частицам форму кубиков желаемого размера.

При использовании желатины или агар-агара вначале подогревают их рас-

творы, затем охлаждают и вносят фермент. В процессе последующего охла-

ждения происходит формирование геля. Полимеризация альгината проис-

ходит в присутствии некоторых катионов. Поэтому на первом этапе сме-

шивают растворы фермента и мономеров этих полисахаридов, далее смесь

с помощью дозирующего устройства вносят в раствор, содержащий ионы

Ca2+ или Ba2+ (для альгината) или Al3+, Fe3+, K+ или Mo2+ (для каррагина-

на), при этом образуются сферические полимерные частицы в виде гра-

нул.

Гели в зависимости от природы используемого полимерного материала

отличаются по ряду показателей. Например, гели ПААГ недостаточно

прочные, но этого можно избежать при использовании ПААГ, содержа-

щего жесткую арматуру из керамики. При увеличении степени сшивки с

целью придания большей прочности гелю возникают проблемы диффузи-

онных затруднений. Альгинатные гели отличаются высокой прочностью и

хорошими гидродинамическими свойствами, что не создает препятствий

для притока к активным центрам молекул ферментов субстрата и оттоку

образуемого продукта. При работе с альгинатом кальция важно отсутст-

вие в иммобилизационной системе хелатирующих агентов (фосфатов,

цитратов), которые, связывая кальций, разрушают структуру геля.

110

Привлекательной для использования является иммобилизация фермен-

тов методом инкапсулирования. В этом методе главным является не соз-

дание физических или химических сил, необходимых для связывания ка-

тализатора с носителем, а удержание раствора, окружающего фермент. В

процессе инкапсулирования иммобилизуются не отдельные молекулы

фермента, а исходный раствор, содержащий фермент. При использовании

метода иммобилизации применительно к ферментам чаще всего приме-

няют коацервацию и межфазовую полимеризацию. Первый прием реали-

зуется без химических реакций и включает фазовое разделение коллоид-

ных частиц полимера, которые ассоциируют вокруг маленьких водных

капель и образуют затем непрерывную мембрану. В качестве полимерных

материалов при этом используют нитрат или ацетат целлюлозы, бутадие-

новый каучук. При межфазовой полимеризации для образования полу-

проницаемой мембраны один из реагентов находится в водной, другой – в

органической фазе; на границе раздела фаз происходит реакция полимери-

зации и вокруг диспергированных в органической фазе капель образуется

слой полимера. С помощью этого метода могут быть получены мембраны

из полиуретана или эпоксидных смол. Полупроницаемые мембраны, по-

крывающие раствор с ферментом, могут быть изготовлены из различных

материалов (полистирола, полиакрилата, полиуретана, полиэфиров, липи-

дов, поликарбонатов и т. д.). Варьируя материалы для получения полу-

проницаемой мембраны, можно осуществлять контроль размеров моле-

кул. Например, большие по размерам молекулы ферментов удерживаются

внутри капсулы, а более мелкие молекулы исходных субстратов и синте-

зируемых продуктов могут свободно диффундировать через мембрану.

Диаметр микросфер может составлять от нескольких микрон до несколь-

ких тысяч микрон при толщине мембран от сотен ангстрем до нескольких

микрон. Безусловным преимуществом микрокапсулирования является

большая площадь поверхности, приходящаяся на единицу активности им-

мобилизованного фермента, что позволяет использовать высокие концен-

трации ферментов в исходном растворе и достигать высокой эффективно-

сти их действия. При этом возможно также придать ферменту способ-

ность функционирования в неводной среде и получать высокие выходы

целевого продукта высокой степени чистоты.

К методу инкапсулирования близок метод обращенных мицелл. Фер-

мент включают в замкнутую структуру из поверхностно-активного веще-

ства (липид, детергент), содержащую микроскопическую каплю воды.

Фермент функционирует на границе раздела двух фаз: органической, на-

ходящейся в биореакторе, и водной, заключенной в обращенную мицеллу.

Существенный интерес представляет способ включения ферментов в

полые волокна. Применяют волокна, изготовленные из природных либо

синтетических полимерных материалов. Раствор фермента вводят во внут-

ренний объем полых волокон и затем «запечатывают» волокно с обоих

111

концов. Фермент в полости волокон не претерпевает каких-либо химиче-

ских модификаций, поэтому сохраняет свою активность и свойства.

Иммобилизация методом поперечных сшивок (или химического при-

соединения) заключается в химическом связывании молекул ферментов

между собой путем образования поперечных сшивок. Для образования

сшивок применяют различные агенты, несущие две и более реакционно

способные группы, которые осуществляют поперечную сшивку фермен-

тов за счет эпокси- и иминогрупп, например, эпоксиполиимины:

CH2 CH CH2

O

NH (CH2)6 NH CH CH2

O

В качестве сшивающих агентов широко применяют также глутаровый

альдегид, гексаметилендиизоцианат, хлорпроизводные триазина. Метод

отличается простотой реализации и позволяет производить сшивку раз-

личных по структуре ферментов, а также ферментов с целыми клетками.

Однако часто при сшивке может происходить изменение существенное

снижение активности катализатора.

Таким образом, методы иммобилизации достаточно разнообразны,

причем имеется возможность использования их в сочетании. Например,

адсорбцию на носителе с инкапсулированием, включение в гелевую

структуру и адсорбцию и т.д. Рассмотренные методы применяются не

только для иммобилизации ферментов, но также и для других биокатали-

заторов – целых клеток, клеточных органелл, антител, антигенов и др. Ни

один из описанных методов не является универсальным, и для каждого

типа катализаторов существуют свои предпочтительные методы. Фермен-

ты иммобилизуют различными адсорбционными методами или методом

поперечных сшивок, лучшим методом для иммобилизации целых клеток

является включение в полимерные структуры.

Помимо создания устойчивых биокаталитических ферментных систем,

важнейшей задачей инженерной энзимологии является изучение физико-

химических свойств данных систем и разработка научных основ их функ-

ционирования и применения.