5000 Нуклеотидов. Было синтезировано 67 олигонуклеотидов, которые с

помощью лигазы соединили в двунитевую ДНК, состоящую из 514 пар

нуклеотидов. Полученный ген встраивали в клетки двух бактерий: E. coli,

Methylophilus methylotrophus, и была получена экспрессия.

Усилия, направленные на получение генноинженерных интерферонов,

по сравнению с методом культуры клеток позволили снизить затраты бо-

лее чем в 100 раз. Были получены различные типы интерферонов на осно-

ве генноинженерных клеток бактерий и дрожжей. Это позволило развер-

нуть медико-биологические и клинические испытания препаратов. Полу-

137

чаемые в течение 1980–1981 гг. препараты интерферонов были очищены

на 80 % и обладали удельной активностью более 107 международных еди-

ниц на 1 мг белка. Расширение клинических испытаний интерферонов,

начатых в этот период, зависит от повышения степени его очистки. Про-

гресс в этом направлении был достигнут применением моноклональных

антител, которые можно использовать для аффинной хроматографии (при

этом нужные белки задерживаются на колонке с антителами).

4.3. Клеточная инженерия

Традиционно для получения более активных биологических агентов

применяли селекцию и мутагенез. Селекция – это направленный отбор

мутантов – организмов, наследственность которых приобрела скачкооб-

разное изменение в результате структурной модификации в нуклеотидной

последовательности ДНК. Генеральный путь селекции – это путь от сле-

пого отбора нужных продуцентов к сознательному конструированию их

генома. Традиционные методы отбора в свое время сыграли важную роль

в развитии различных технологий с использованием микроорганизмов.

Были отобраны штаммы пивных, винных, пекарских, уксуснокислых и др.

микроорганизмов. Ограничения метода селекции связано с низкой часто-

той спонтанных мутаций, приводящих к изменению в геноме. Ген должен

удвоиться в среднем 106–108, чтобы возникала мутация.

К существенному ускорению процесса селекции ведет индуцирован-

ный мутагенез (резкое увеличение частоты мутаций биологического объ-

екта при искусственном повреждении генома). Мутагенным действием

обладают ультрафиолетовое и рентгеновское излучение, ряд химических

соединений (азотистая кислота, бромурацил, антибиотики и пр.). После

обработки популяции мутагеном проводят тотальный скрининг (проверку)

полученных клонов и отбирают наиболее продуктивные. Проводят по-

вторную обработку отобранных клонов, и вновь отбирают продуктивные

клоны, то есть проводят ступенчатый отбор по интересующему признаку.

Работа эта требует больших трудозатрат и времени. Недостатки сту-

пенчатого отбора могут быть в значительной степени преодолены при

сочетании его с методами генетического обмена.

Генетическое конструирование in vivo (клеточная инженерия)

включает получение и выделение мутантов и использование различ-

ных способов обмена наследственной информацией живых клеток.

Основой клеточной инженерии является слияние неполовых клеток

(гибридизация соматических клеток) с образованием единого целого.

Слияние клеток может быть полным, или клетка-реципиент может приоб-

рести отдельные части донорской клетки (митохондрии, цитоплазму,

ядерный геном, хлоропласты и др.). К рекомбинации ведут различные

процессы обмена генетической информацией живых клеток (половой и

парасексуальный процесс эукариотических клеток; конъюгация, транс-

138

формация и трансдукция у прокариот, а также универсальный метод –

слияние протопластов).

При гибридизации берут генетически маркированные штаммы микро-

организмов (чаще ауксотрофные мутанты или мутанты, устойчивые к ин-

гибиторам роста). В результате слияния клеток (копуляции) происходит

образование гибридов у дрожжей, грибов, водорослей. Если исходные

клетки были гаплоидными, в результате слияния ядер появляется дипло-

идная клетка (зигота), несущая в ядре двойной набор хромосом. У отдель-

ных представителей ядро сразу подвергается мейозу, в ходе которого ка-

ждая из хромосом расщепляется. Гомологичные хромосомы образуют

пары и обмениваются частями своих хроматид в результате кроссингове-

ра. Далее формируются гаплоидные половые споры, каждая из которых

содержит набор генов, которыми различались родительские клетки, в ре-

зультате рекомбинации генов одной и той же хромосомы, а также разных

хромосом при распределении хромосомных пар. Если после слияния ядра

не сливаются, образуются формы со смешенной цитоплазмой и ядрами

разного происхождения (гетерокарионы). Такие формы свойственны гри-

бам, особенно продуцентам пенициллинов. При размножении полученных

гетерозиготных диплоидов или гетерокарионов происходит расщепление

– проявление в потомстве, обнаруживающих не только доминантные, но и

рецессивные признаки родителей. Половой и парасексуальный процесс

широко используют в генетической практике промышленно важных мик-

роорганизмов-продуцентов.

У бактерий обмен генетической информацией происходит в результате

взаимодействия конъюгативных плазмид (конъюгации). Впервые

конъюгацию наблюдали у E. coli K-12. Для конъюгационного скрещива-

ния культуру донора и реципиента смешивают и совместно инкубируют в

питательном бульоне или на поверхности агаризованных сред. Клетки при

помощи образующегося конъюгационного мостика соединяются между

собой; через мостик осуществляется передача определенного сайта плаз-

мидной хромосомы к реципиенту. Так, при 37°С для переноса всей хромо-

сомы требуется около 90 минут. Конъюгация открыла и открывает широ-

кие перспективы для генетического анализа и конструирования штаммов.

Трансдукция – процесс переноса генетической информации от

клетки реципиента к клетке-донору с помощью фага. Впервые этот

процесс был описан в 1952 г. Циндером и Лидербергом. Трансдукция ос-

нована на том, что в процессе размножения фагов в бактериях возможно

образование частиц, которые содержат фаговую ДНК и фрагменты бакте-

риальной ДНК. Для осуществления трансдукции нужно размножить фаг в

клетках штамма-донора, а затем заразить им клетки-реципиента. Отбор

рекомбинантных форм проводят на селективных средах, не поддержи-

вающих роста исходных форм.

139

В последние годы очень широко применяют метод слияния прото-

пластов. Этот метод, видимо, является универсальным способом введе-

ния генетической информации в клетки различного происхождения. Про-

стота метода делает его доступным для селекции промышленно важных

продуцентов. Метод открывает новые возможности для получения меж-

видовых и межродовых гибридов и скрещивания филогенетически отда-

ленных форм живого. Получены положительные результаты слияния бак-

териальных, дрожжевых и растительных клеток. Получены межвидовые и

межродовые гибриды дрожжей. Имеются данные о слиянии клеток раз-

личных видов бактерий и грибов. Удалось получить гибридные клетки в

результате слияния клеток организмов, относящихся к различным царст-

вам: животного и растительного. Ядерные клетки лягушки были слиты с

протопластами моркови; гибридная растительно-животная клетка росла на

средах для растительных клеток, однако, достаточно быстро утрачивала

ядро и покрывалась клеточной стенкой.

Достаточно успешно в последние годы проводятся работы по созда-

нию ассоциаций клеток различных организмов, то есть получают смешан-

ные культуры клеток двух или более организмов с целью создания искус-

ственных симбиозов. Успешно проведены опыты по введению азотфикси-

рующего организма Anabaena variabilis в растения табака. Попытки введе-

ния A. variabilis непосредственно в черенки зрелых растений табака не

дали положительных результатов. Но при совместном культивировании

мезофильной ткани табака и цианобактерий удалось получить растения-

регенеранты, содержащие цианобактерии. Получены ассоциации клеток

женьшеня и паслена с цианобактерией Chlorogleae fritschii.

Перспективно клональное размножение животных клеток для генети-

ческих манипуляций. Большие перспективы имеет техника клеточных

культур животных клеток для получения биологически активных соеди-

нений, хотя делает пока только первые шаги. Культуры опухолевых кле-

ток или нормальные клетки, трансформированные ______in vitro, сохраняют в

ряде случаев способность синтезировать специфические продукты. Не-

смотря на много, пока не преодоленных трудностей, показана возмож-

ность получения ряда веществ в культуре животных клеток:

Продукт Клетки или их источник

Гормон роста Опухоль гипофиза

Коллаген Фибробласты

Кортикостероиды Опухоль надпочечника

Гистамин Опухоль из тучных клеток

Меланин Меланома радужной

оболочки сетчатки

Мукополисахариды Фибробласты

Фактор роста нервной ткани Нейробластома

Важное направление клеточной инженерии связано с ранними эмбрио-

нальными стадиями. Так, оплодотворение яйцеклеток в пробирке позволяет

140

преодолеть бесплодие. С помощью инъекции гормонов можно получить от

одного животного десятки яйцеклеток, искусственно их оплодотворить in