2.103 Копий на клетку.

При получении библиотеки генов растений и высших животных, у ко-

торых общая длина генома составляет до 3⋅109 и более, емкость вектора

часто играет решающую роль. В данном случае в качестве вектора ис-

пользуют ДНК фага λ. При помощи специальных методов рекомбинант-

ные ДНК вводят прямо в фаговые головки. Еще большей емкостью обла-

дают плазмиды – космиды (до 40 кб), у которых cos-фрагмент генома фага

λ, участвует в упаковке ДНК в фаговую частицу на конечной стадии раз-

вития. Для упаковки ДНК необходимо, чтобы ДНК содержала COS-

участок и ее размер был примерно равным размеру генома ага l. Достиг-

нутые методы упаковки ДНК в фаговую головку при помощи космид по-

зволяют получать библиотеки генов практически любых организмов.

Перенос генов в клетки организма-реципиента

Перенос рекомбинантных ДНК осуществляется путем трансформа-

ции или конъюгации. Трансформация – это процесс изменения генетиче-

ских свойств клетки в результате проникновения в нее чужеродной ДНК.

Впервые она была обнаружена у пневмококков Ф. Гиффитом, который

показал, что некоторые клетки невирулентных штаммов бактерий при

заражении ими мышей совместно с вирулентными штаммами приобрета-

ют патогенные свойства. В дальнейшем трансформация была продемонст-

рирована и изучена у различных видов бактерий.

Установлено, что к трансформации способны лишь некоторые, так

называемые «компетентные», клетки (способные включать чужеродную

ДНК и синтезирующие особый трансформирующий белок). Компетент-

ность клетки определяется также факторами внешней среды. Этому мо-

жет способствовать обработка клеток полиэтиленгликолем или хлори-

дом кальция. После проникновения в клетку одна из нитей рекомби-

нантной ДНК деградирует, а другая за счет рекомбинации с гомологич-

ным участком реципиентной ДНК может включиться в хромосому или

внехромосомную единицу. Трансформация является наиболее универ-

сальным способом передачи генетической информации и имеет наи-

большее значение для генетических технологий.

Конъюгация – один из способов обмена генетического материала, при

котором происходит однонаправленный перенос генетической информа-

ции от донора к реципиенту. Этот перенос находится под контролем осо-

бых конъюгативных плазмид (фактор фертильности). Перенос информа-

ции от донорской клетки в реципиентную осуществляется через специ-

альные половые ворсинки (пили). Возможна передача информации и с

помощью неконъюгативных плазмид при участии плазмид-помощниц.

129

Передача всего набора генов вируса или фага, приводящая к развитию

в клетке фаговых частиц, называется трансфекцией. Методика примени-

тельно к бактериальным клеткам включает получение сферопластов, очи-

стку инкубационной среды от нуклеаз и добавление очищенной фаговой

ДНК (присутствие протаминсульфата повышает эффективность транс-

фекции). Методика применима к животным и растительным клеткам с

участием специальных челночных вирусных векторов.

Скрининг и отбор рекомбинантных клеток

После переноса сконструированных ДНК, как правило, лишь небольшая

часть реципиентных клеток приобретает необходимый ген. Поэтому очень

важным этапом является идентификация клеток, несущих ген-мишень.

На первой стадии идентифицируют и отбирают клетки, несущие век-

тор, на основе которого осуществлен перенос ДНК. Отбор проводят по

генетическим маркерам, которыми помечен вектор. Главным образом

маркерами являются гены устойчивости к антибиотикам. Поэтому отбор

проводят высевом клеток на среды, содержащие конкретный антибиотик.

После высева на этих средах вырастают только клетки, в составе которых

находится вектор с генами антибиотиковой устойчивости.

На второй стадии отбирают клетки, несущие вектор и ген-мишень. Для

этого используют две группы методов: 1) основанные на непосредствен-

ном анализе ДНК клеток-реципиентов и 2) основанные на идентификации

признака, кодируемого геном-мишенью. При использовании первой груп-

пы методов из клеток, предположительно содержащих нужный ген, выде-

ляют векторную ДНК, и в ней проводится поиск участков, несущих дан-

ный ген. Далее проводят секвенирование части нуклеотидной последова-

тельности гена. Возможен другой метод – гибридизация выделенной из

клеток ДНК с зондом (искомый ген или соответствующая ему мРНК); вы-

деленную ДНК переводят в одноцепочечное состояние и вводят ее во

взаимодействие с зондом. Далее определяют наличие двуцепочечных гиб-

ридных молекул ДНК. Во втором варианте возможен непосредственный

отбор клеток, синтезирующих белок – продукт транскрипции и трансля-

ции гена-мишени. Применяются также селективные среды, поддержи-

вающие рост только клеток, приобретших ген-мишень.

С помощью методов генетической инженерии возможно конструиро-

вание новых форм микроорганизмов по заданному плану, способных син-

тезировать разнообразные продукты, в том числе эукариотических орга-

низмов. Рекомбинантные микробные клетки быстро размножаются в кон-

тролируемых условиях и способны утилизировать при этом разнообраз-

ные, в том числе, недорогие субстраты.

Основные проблемы, возникающие при генетических манипуляциях,

заключаются в следующем: 1) гены при трансформации, попадая в чуже-

родную среду, подвергаются воздействию протеаз, поэтому их надо за-

щищать; 2) как правило, продукт трансплантированного гена аккумулиру-

130

ется в клетках и не выделяется в среду; 3) большинство желаемых призна-

ков кодируется не одним, а группой генов. Все это существенно затрудня-

ет перенос и требует разработки технологии последовательной трансплан-

тации каждого гена.

К настоящему времени генетическая инженерия освоила все царства

живого. Фенотипическое выражение «чужих» генов (экспрессия) получе-

ны у бактерий, дрожжей, грибов, растений и животных. Блестящие успехи

достигнуты на клетках наиболее и всесторонне изученных микроорганиз-

мов. Эра рекомбинантных ДНК применительно к растениям и высшим

животным только начинается. В области генетической инженерии живот-

ных клонированы гены β-глобина мышей, фага λ. Помимо почечных кле-

ток зеленой африканской мартышки, испытываются все новые виды куль-

туры животных клеток, в том числе клетки человека. Например, в клетках

непарного шелкопряда с применением вирусного вектора удалось добить-

ся экспрессии гена β-интерферона человека. Этот ген также клонирован в

клетках млекопитающих. В генетической инженерии человека, как и в

генетическом конструировании растений, пока не достигнуто тканеспеци-

фического выражения генов. Решения данной проблемы ищут на путях

введения определенных промоторов регуляторных участков в конструи-

руемые векторы. Пока остается достаточно отдаленной задачей возмож-

ность улучшения сельскохозяйственных пород животных. К настоящему

времени практически нет сведений по генетике таких признаков, как плодо-

витость, выход и жирность молока, повышение устойчивости к болезням и

др. Это препятствует попыткам генетических манипуляций в данной облас-

ти.

Генетическая инженерия дает в руки биотехнологов не только новые

продуценты ценных соединений, но и улучшает и повышает эффектив-

ность ценных свойств уже традиционно используемых организмов. Рас-

пространенным методом повышения выхода полезного продукта является

амплификация – увеличение числа копий генов. Образование многих

целевых продуктов (аминокислот, витаминов, антибиотиков и др.) харак-

теризуется длинным биохимическим путем синтеза, который управляется

не одним, а десятками генов. Выделение этих генов и клонирование с по-

мощью амплификации представляет довольно трудную, но в ряде случаев

возможную задачу. Повышение выхода полезного продукта достигается

также с помощью локализованного (сайт-специфического) мутагенеза