3.3.8. Препараты ферментов поджелудочной железы крупного рогатого скота

К препаратам ферментов поджелудочной железы крупного рогатого скота относятся:

• дезоксирибонуклеазы (ДНКазы);

• рибонуклеазы (РНКазы);

• трипсин;

• химотрипсин;

Принцип производства заключается в том, что измельченную поджелудочную железу подвергают автолизу, для чего смешивают ее с половинным количеством воды и оставляют на 18 ч при температуре 12 °С. Затем в реакторе с мешалкой проводят экстракцию методом бисмацерации водой, подкисленной кислотой орто-фосфорной до значения рН 2,0—2,5, при температуре не выше 5 °С. Первая мацерация проводится с двойным количеством воды в течение 16 ч, вторая — с однократным, 1 ч. Экстракты отделяют от жмыха центрифугированием и объединяют. Жмых используют для получения инсулина, а из экстракта высаливают ферменты (ДНКазу и РНКазу) различными концентрациями аммония сульфата, добавляя кристаллический аммония сульфат до определения степени насыщения при перемешивании и охлаждении. Фильтрат используют для получения химотрипсина, трипсина и пантрипина.

Высол растворяют в воде и в водном растворе осаждают сопутствующие вещества добавлением аммония сульфата. Осадок отбрасывают, а к фильтрату добавляют 5 Н раствором натрия гидроксида до значения рН 4,5 и высаливают ДНКазу, медленно добавляя насыщенный раствор аммония сульфата до степени насыщения 0,4. Осадок ДНКазы отделяют и подвергают дальнейшей очистке. Из фильтрата осаждают РНКазу высаливанием аммония сульфатом до степени насыщения 0,8. Высол, содержащий аморфную РНКазу, отстаивают при 4—5 °С в течение 40—48 ч, жидкость сифонируют, а осадок отделяют на нутч-фильтре или центрифугированием. Полученную РНКазу очищают. Из фильтрата, содержащего комплекс ферментов, аммония сульфатом при степени насыщения 0,7 высаливают химотрипсин, трипсин и пантрипсин.

Из смеси ферментов получают неактивный химотрипсиноген. Для этого осадок растворяют в воде, подкисленной кислотой серной до значения рН 3,0, при температуре не выше 5 °С и медленно добавляют при перемешивании раствор аммония сульфата. Затем раствор подщелачивают 5 н раствором натрия гидроксида до значения рН 5,0 и выдерживают при комнатной температуре до полного осаждения кристаллического химотрипсиногена.

Из фильтрата и промывных вод, полученных после отделения химотрипсиногена, выделяют трипсиноген высаливанием аммония сульфатом при подкислении 5 н серной кислотой до значения рН 3,0.

Фильтрат, оставшийся после выделения трипсина, подкисляют кислотой хлороводородной до значения рН 2,5 при температуре 5 °С. Из подкисленного фильтрата добавлением кристаллического магния сульфата высаливают пантрипин совместно с балластными белками. Последние удаляют коагуляцией при нагревании раствора до температуры 90 °С в течение 1 мин и быстром охлаждении до температуры 20—25 °С. Осадок балластных веществ отделяют фильтрованием. К фильтрату, объединенному с промывными водами, медленно при перемешивании добавляют кристаллический аммония сульфат и отстаивают в течение 12 ч при комнатной температуре. В результате образуются два осадка: аморфный и кристаллический. Темный аморфный осадок пантри-пина отделяют от белого кристаллического осадка сопутствующих веществ. Осадок пантрипина растворяют в воде и диализируют. По окончании диализа раствор фильтруют, стандартизуют по сухому остатку и силе ингибирующего действия пантрипина. Проводят стерилизующую фильтрацию, разливают во флаконы и подвергают сублимационной сушке.

Очистка индивидуальных ферментов продолжается несколько дней и состоит из ряда многократно повторяющихся операций.

Проводят трехкратное высаливание ферментов аммония сульфатом до различной степени насыщения, изменения значения рН. Каждый раз из фильтрата предварительно удаляют сопутствующие вещества аммония сульфатом меньшей концентрации, чем применяется при высаливании ферментов, затем осуществляют пятикратную перекристаллизацию ферментов. Химотрипсиноген и трипсиноген активируют до образования химотрипсина и трипсина в соответствующих буферных растворах при пониженной температуре и при добавлении кристаллика трипсина. Обессоливают ферменты диализом через целлофановую пленку. Сульфат-ионы осаждают бария хлоридом, а избыток иона бария удаляют на катионах КУ-2. В обессоленных растворах ферментов устанавливают необходимое значение рН, определяют концентрацию сухого вещества и разбавляют водой очищенной в соответствии с конечным содержанием сухого препарата во флаконах. Разбавленные растворы фильтруют через стерилизующие фильтры, разливают во флаконы и подвергают сублимационной сушке.