Вопрос №48: особенности репликации различных геномов у про- и эукариот.

E.coli - это бактерия, содержащая двухцепочечную кольцевую ДНК. Репликация ДНК Е. coli изучена весьма детально, и нам известны механизмы многих стадий этого процесса. Эти механизмы характерны для репликации всех прокариот. Аналогичным образом протекает репликация у эукариот, но в ней участвуют другие ферменты.

ДНК-полимеразы — это ферменты, участвующие в синтезе ДНК. Ферменты присоединяют нуклеотид к —ОН-группе на З'-конце одной из цепей ДНК, которая, следовательно, растет в направлении 5' —> 3'. По-этому говорят, что данные ферменты обладают 5' —>З'-полимеразной активностью. Для синтеза новой цепи ДНК необходимы: 1) ДНК-матрица, которая может быть как в одно-, так и в двухцепочечной форме; 2) дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (ATP, CTP, GTP и ТТР) и 3) З'-ОН-группа нуклеиновой кислоты-затравки, к которой присоединяется следующее основание.

Репликативная вилка – это та часть молекулы ДНК, в которой в данный момент осуществляется синтез новой ДНК. Здесь родительская ДНК расплетена и находится в одноцепочечной форме. Каждая из цепей служит матрицей для синтеза новой ДНК. В ходе синтеза репликативная вилка перемещается вдоль молекулы, и при этом расплетаются все новые участки родительской ДНК — до тех пор, пока вилка не дойдет до точки окончания синтеза (точка терминации). Поскольку ДНК-полимеразы катализируют репликацию только в направлении 5' —» 3', а цепи родительской ДНК антипараллельны, только одна из новых цепей синтезируется непрерывно; она называется лидирующей. Вторая цепь, называемая отстающей, синтезируется в виде фрагментов, которые затем сшиваются (лигируются), и образуется непрерывная вторая цепь. Этот процесс называется созреванием. Фрагменты ДНК, о которых идет речь, называются фрагментами Оказаки, по имени исследователя, который их впервые обнаружил. У прокариот они имеют длину около 1000 нуклеотидов, а у эукариот — 100—200 нуклеотидов.

Для синтеза ДНК необходима ^ РНК - затравка. Поскольку для своей работы ДНК-полимераза нуждается в свободной З'-ОН-группе, возникает вопрос, как начинается синтез ДНК. В результате многочисленных исследований было показано, что синтез начинается на маленьком фрагменте РНК, выступающей в роли затравки (праймера). Сначала фермент РНК-полимераза, не нуждающийся для инициации синтеза в свободной З'-ОН-группе, синтезирует короткую молекулу РНК (длиной 10—60 нуклеотидов), используя в качестве матрицы родительскую двухцепочечную ДНК. Эта РНК-затравка остается спаренной с расплетенной ДНК и действует как место инициации синтеза, предоставляя свою свободную З'-ОН-группу для присоединения первого нуклеотида ДНК; эту последнюю операцию производит ДНК-полимераза III. Аналогичная затравка образуется и перед синтезом отстающей цепи, но, поскольку матрицей для ее образования служит одноцепочечная ДНК, бактерии часто используют для синтеза u1056 РНК-затравки другой фермент - праймазу. РНК-матрица удаляется из молекулы ДНК в процессе созревания с помощью poll.

При созревании РНК-затравка удаляется как с 5'-конца лидирующей цепи, так и с 5'-концов фрагментов Оказаки, а эти фрагменты сшиваются друг с другом. Удаление РНК-затравки осуществляется с помощью ДНК-полимеразы I, действующей как У —> 5'-экзонуклеаза. Этот же фермент присоединяет вместо удаленной РНК дезоксинуклеотиды, используя при этом свою 5' —> З'-полимеразную активность. Наконец, фермент ДНК-лигаза соединяет в нужном порядке фрагменты ДНК, катализируя образование фосфодиэфирной связи.

«Корректорская правка» — это удаление неправильных (образующих некомплементарные пары) оснований, включенных во вновь синтезированную ДНК. Этот процесс обеспечивает чрезвычайно высокую точность репликации, отвечающую одной ошибке на 109 пар оснований. Коррекция осуществляется в тех случаях, когда к З'-концу растущей цепи присоединяется «неправильный» нуклеотид, неспособный образовывать нужные водородные связи с матрицей. Когда polIII ошибочно присоединяет неправильное основание, «включается» ее 3'—5'-экзонуклеазная активность, и это основание немедленно удаляется, после чего восстанавливается полимеразная активность. Такой простой механизм действует благодаря тому, что pollII способна работать как полимераза лишь на совершенной двойной спирали ДНК с абсолютно правильным спариванием оснований.

Расплетание двойной спирали РНК необходимо для того, чтобы цепи ДНК могли разойтись и играть роль матриц при репликации. У Е. сой имеется особый фермент, так называемый rep-белок, который выполняет функцию расплетания двойной спирали. Энергия, необходимая для этого, получается за счет гидролиза АТР. Образовавшиеся при расплетании одноцепочечные участки ДНК стабилизируются в этом состоянии целым рядом белков: это белок, связывающийся с одноцепочечной ДНК, белок, дестабилизирующий двойную спираль, ДНК-связывающий белок и белок, расплетающий двойную спираль.

Топоизомеразы— ферменты, катализирующие переходы в молекулах ДНК, связанные с изменением степени сверхспирализации. ДНК, различающиеся только по степени сверхспирализации, называются топологическими изомерами или топоизомерами, отсюда и название ферментов — топоизомеразы. Одни топоизомеразы вызывают релаксацию сверхспиральной ДНК, а другие, напротив, приводят к появлению в ней сверхвитков. ДНК-гираза Е. coli переводит двухцепочечную кольцевую ДНК в состояние с отрицательной сверхспирализацией. Это необходимо для снятия положительных сверхвитков, возникающих при репликации (и транскрипции) из-за раскручивания двойной спирали ДНК.

Репликация у эукариот.

Почти все, что мы знаем о репликации ДНК, удалось выяснить в опытах с очищенными мультиферментными системами бактерий и бактериофагов, способными осуществлять репликацию ДНК in vitro. Получение таких систем в 1970-х годах заметно облегчилось после того, как удалось выделить мутанты по целому ряду различных генов, ответственных за репликацию, которые можно было использовать для идентификации и очистки соответствующих белков.

У эукариот энзимология репликации ДНК пока еще детально не изучена, главным образом потому, что получать здесь необходимые мутантные формы гораздо труднее. Однако схема репликации у прокариот и эукариот в основных чертах, включая геометрию репликационной вилки и потребность в РНК-затравке, по-видимому, одинакова. Главное различие заключается в том, что у эукариот ДНК реплицируется не как таковая, а в виде хроматина, в котором она прочно связана с белками, принадлежащими к классу гистонов. Гистоны образуют комплексы в форме дисков, вокруг которых обвивается эукариотическая ДНК, в результате чего возникают регулярно повторяющиеся структуры, называемые нуклеосомами. Нуклеосомы располагаются вдоль молекулы ДНК с интервалами 200 пар оснований. Быть может, именно этим объясняется тот факт, что новые фрагменты отстающей цепи ДНК закладываются у эукариот с интервалами в 10 раз более короткими (от 100 до 200 нуклеотидов), чем у бактерий (от 1000 до 2000 нуклеотидов). Кроме того, если нуклеотиды служат барьерами, на время останавливающими продвижение ДНК-полимеразы, присутствие хроматина (а не голой ДНК) может, вероятно, объяснить и то, что репликационные вилки движутся у эукариот приблизительно в 10 раз медленнее, чем у бактерий.