Занятие 7

Основные механизмы обмена веществ.

Культуральные свойства бактерий. Пигменты.

Бактериальные ферменты, классификация, методы определения

Студент должен:

• знать:

• основные механизмы обмена веществ;

• культуральные свойства бактерий, пигменты; ферментативную активность микроорганизмов, методы ее определения;

• принципы и методы современной идентификации бактерий;

• способы размножения микроорганизмов, особенности размножения риккетсий, хламидий, актиномицетов;

• рост и кинетику микробной популяции, параметры кривой роста;

• биосинтетические процессы в микробной клетке;

• методы количественного определения бактерий в исследуемом материале (общего числа и числа жизнеспособных клеток);

• уметь:

• выделять чистые культуры аэробов и анаэробов;

• описывать культуральные свойства микроорганизмов;

• определять сахаролитические, протеолитические ферменты, уреазную активность и др.

• определять количество жизнеспособных клеток в исследуемом материале.

Вопросы для проверки исходного уровня знаний

1. Бактериальные ферменты, их классификация по характеру субстрата (индуцибельные, репрессибельные, конститутивные), условиям синтеза и механизму действия. Ферменты агрессии.

2. Этапы бактериологического метода. Принципы идентификации выделенной чистой культуры.

3. Пигменты бактерий. Химическая природа, свойства. Примеры пигментобразующих бактерий.

4. Основные механизмы обмена веществ. Пути катаболизма гексоз, цикл трикарбоновых кислот, дыхательная цепь и фосфорилирование.

5. Получение энергии бактериями (субстратное, окислительное фосфорилирование). Брожение и его сущность, виды брожения.

6. Биосинтетические процессы в бактериальной клетке. Пути синтеза нуклеотидов, аминокислот, липидов, полисахаридов и др.

7. Отношение бактерий к кислороду. Аэробы, анаэробы, микроаэрофилы, аэротолерантные бактерии.

8. Методы культивирования анаэробов, применяемые среды, аппаратура. Методы выделения чистой культуры облигатных спорообразующих и неспорообразующих анаэробов.

9. Основные этапы деления клетки. Кривая роста бактерий.

10. Методы количественной оценки микробной популяции. Определение общего числа и количества жизнеспособных клеток.

Самостоятельная работа студентов

Задание 8. Описание культуральных свойств роста микроорганизмов на жидких и плотных питательных средах по схеме. Результаты отразить в следующей таблице:

№	Признаки	Колония 1	Колония 2	Колония 3
1	Форма
2	Величина
3	Степень прозрачности
4	Цвет
5	Характер поверхности
6	Характер краев
7	Внутренняя структура
8	Консистенция
9	Хорошо или плохо эмульгируется в капле воды
10	Микроскопическая картина в мазке по Граму (зарисовать)
11	Рисунок внешнего вида колоний по признакам 1, 2, 3, 4, 5, 6

Примечание: Признаки 1–3 изучаются при просмотре чашек «на просвет» против источника света; 4 и 5 – в падающем свете (характер поверхности – гладкая, блестящая, шероховатая, выпуклая, плоская); 6 и 7 – при малом увеличении микроскопа, положив на предметный столик чашку вверх дном; 8 и 9 – в процессе приготовления мазка.

Задание 9. Определение ферментативных свойств бактерий. Результаты отразить в следующей таблице:

День	Материал	Ход исследования	Результат
1	Культура бактерий на скошенном агаре Пластина биохимическая, дифференцирующая энтеробактерии (ПБДЭ) (демонстрация)	1. Посев в столбик среды с желатином. 2. Посев на среды Гисса. 3. Посев в МПА, к пробке при-крепить лакмусовую бумажку, бумажки с щавелевой кислотой и ацетатом свинца. 4. Оценить результаты определения ферментативной уреазной активности бактерий мик-рометодом энзимоидентификации с помощью ПБДЭ. 5. Оценить результаты с помо-щью компьютерной программы «Энтероид»
2	Результаты посева	Описать результаты, сделать выводы

Задание 10. Выделение спорообразующих анаэробных бактерий. Результаты отразить в следующей таблице:

День	Материал	Ход исследования	Результат
1	Суспензия почвы в стерильном физрастворе	а) посев почвенной суспензии на среду Китта-Тароцци, предварительно прогретую при 80 °С 30 мин на водяной бане и остуженную до 45 °С; б) инкубация в термостате при 37 °С
2	Посевы на среде Китта-Тароцци	а) описание культуральных свойств; б) приготовление препарата, окраска по Граму

Задание 11. Выделение чистой культуры облигатных неспорообразующих анаэробов из клинического материала (гной из абцесса, флегмон, содержимое раны, желчь, экссудат из брюшной полости). Результаты отразить в следующей таблице:

День	Материал	Ход исследования	Результат
1	Клинический материал в транспортной среде	Произвести посев на кровяной агар, чашки поместить в анаэростат или в эксикатор с химическими адсорбентами кислорода. Анаэростат (экси-катор) поместить в термостат, инкубировать при 37 °С 24–36 ч.
2	Посевы на кро-вяном агаре в анаэростате (эксикаторе)	Микроскопия, описание коло-ний; тест на способность ко-лоний светиться при УФ-об-лучении красным светом; тест на аэротолерантность

Задание 12. Определить количество жизнеспособных клеток в материале различными методами. Результаты отразить в следующей таблице:

День	Материал	Ход исследования	Результат
1	Культуральная жидкость	1) произвести посев по Гоулди; 2) сделать несколько десятикратных разведений; по 0,1 мл 2 и 3 раз-ведений посеять на поверхность МПА, распределить шпателем
2	Посевы на чашках	Подсчитать количество жизнеспособных клеток (количество колоний), сравнить результаты 2 методов

Измерение роста бактерий

В работе по измерению бактериального роста необходимо пользоваться четким определением роста. Один из главных подходов к определению роста основан на способности микроорганизмов размножаться, т.е. начинать и завершать клеточное деление. Такой подход предполагает возможность контроля увеличивающегося числа дискретных бактериальных частиц. Так как некоторые клетки могут быть мертвыми, вышеуказанное определение роста отличается от определения, основанного на подсчете живых клеток.)

Прямой подсчет общего числа клеток

1. Подсчет под микроскопом в тонком слое с использованием специальных камер (камера Хауксли, камера Петрова-Хаузера).

2. Электронный подсчет. Разбавленная бактериальная суспензия подается через маленькое отверстие (жиклер), соединяющее две камеры с жидкостью. В каждой камере с помощью электродов измеряется электрическое сопротивление. Несмотря на то, что электропроводность среды достаточно велика, размер жиклера настолько мал, что электрическое сопротивление в нем несоизмеримо выше, чем в остальном объеме. Когда частица переносится через жиклер с жидкостью, сопротивление возрастает еще сильнее, так как электропроводность бактерий ниже, чем среды. Эти изменения сопротивления улавливаются с помощью измерительной цепи и превращаются в импульс напряжения или силы тока. Подсчет импульсов подобен подсчету радиоактивности, причем очень слабые импульсы элиминируются с помощью дискриминатора.

3. Метод мембранных фильтров, если на 1 мл приходится менее 10 клеток. Морскую, прудовую или питьевую воду пропускают через мембранный фильтр, затем его сушат, окрашивают, просветляют и производят подсчет клеток под микроскопом.

Подсчет жизнеспособных клеток

Обычно подсчитывают число колоний, образованных жизнеспособными клетками в благоприятных для роста условиях.

1. Метод посева в агар: пробу вносят пипеткой в пустую стерильную чашку Петри, в которую затем вливают расплавленный, но остуженный до 45 °С агар; содержимое осторожно перемешивают и дают агару остыть. После инкубирования подсчитывают число колоний в толще питательной среды и на поверхности.

2. Метод посева на поверхность агара: небольшие (0,1 мл) объемы разбавленной культуры вносят пипеткой непосредственно на поверхность затвердевшего агара в чашке Петри и затем клетки распределяют по поверхности с помощью стеклянного или тефлонового шпателя.

3. Метод посева в многослойный агар: похож на предыдущий. Отличается тем, что на верхний слой засеянного застывшего агара наливают пипеткой дополнительный слой стерильного агара.

Применение всех этих методов предусматривает подсчет клеток одного вида из гомогенных суспензий; эти методы непригодны для подсчета клеток разных видов из смешанных популяций.