Окраска по Романовскому-Гимзе

Для окраски мазков крови всегда используют свежеприготовленный рабочий раствор краски. Для разведения лучше всего пользоваться фосфатным буфером. Фиксированные сухие мазки помещают в контейнер, который опускают в кювету с рабочим раствором красителя и выдерживают в нем строго определенное время, подобранное для каждой партии, краски, - от 20 до 40 минут. Затем контейнер переносят в кювету с водопроводной водой, после чего мазки ставят вертикально в штатив для сушки. При отсутствии штатива-контейнера высушенные мазки красят на «рельсах», заливая мазок рабочим раствором красителя возможно более высоким слоем (3-4 мл на мазок).

Критерии правильности окраски мазка крови при использовании любого метода окрашивания: эозинофильные гранулы розово-оранжевого цвета, эритроциты светло-розовые, нейтрофильная зернистость мелкая фиолетовая.

В последние годы широко используется автоматическая окраска мазков крови и костного мозга с помощи специальных аппаратов («Нематек» фирмы «Амес» США и др.). Автоматическое дозирование красителей и буферных растворов обеспечивает стандартную и равномерную окраску.

Подсчет лейкоцитарной формулы

1. Окрашенный мазок крови микроскопируют с иммерсионной системой (используют окуляр 7 или 10 и объектив 90, конденсор поднимают до упора, диафрагму открывают, на мазок наносят каплю иммерсионного масла, объектив погружают в него до соприкосновения с препаратом).

2. Под контролем глаза медленным осторожным движением макровинта поднимают тубус до получения с препаратом.

3. Четкости его добиваются с помощью микровинта.

4. Считают все встречающиеся лейкоциты, дифференцируя их по видам. Всего сосчитывают 200 клеток (регистрация лейкоцитов во время подсчета производится с помощью счетчика лабораторного; за суммой лаборант может не следить, так как, когда будет подсчитано 100 и 200 клеток раздастся звонок).

5. Наиболее употребительный метод подсчета:

• по верхнему и нижнему краю мазка сосчитывают по 100 клеток, двигая его по ломаной линии «МЕАНДРА»

• просмотрев 5-6 полей зрения по краю, мазок передвигают на 5-6 полей зрения к середине стекла, а затем в сторону на столько же и возвращаются к краю.

• Снова просматривают край и т. д.

6. Второй способ подсчета:

• считают клетки в начале мазка от края до края поперек него

• затем 5-6 полей зрения по краю

• снова поперек мазка

• затем по противоположному краю и т. д.

7. После подсчета (подсчитывают число лейкоцитов каждого вида и делят на 2, чтобы получить количество их относительно 100 клеток, т. е. процентное соотношение), записывают в бланк исследования.

8. Сравнивают полученный результат с нормальными показателями лейкоцитарной формулы.

Для подсчета следующей лейкоцитарной формулы, цифры на счетчике надо сбросить до появления во всех смотровых окнах нулей.

Принцип морфологической дифференциации клеток крови в окрашенных препаратах

При дифференциации кровяных клеток в окрашенных препаратах имеют значение следующие морфологические признаки:

1. Величина и форма клетки

2. Ядерно-цитоплазматическое отношение

3. Форма и хроматиновое строение ядра

4. Наличие или отсутствие нуклеол в ядре, их число и величина

5. Цвет и структура цитоплазмы

6. Наличие в цитоплазме зернистости (величина, форма, цвет), вакуолей и фагоцитированных элементов.

Величина кровяных клеток подвергается значительным индивидуальным колебаниям. Молодые клетки преимущественно крупнее зрелых. Форма клеток чаще круглая, реже неправильная. Изменения формы в ряде случаев имеют диагностическое значение, например изменения формы эритроцитов (пойкилоцитоз, сфероцитоз, овалоцитоз и т. д.).

Отношение ядро-цитоплазма обычно тем больше, чем моложе клетка. Особенно показательно увеличение ядерно-цитоплазматического отношения в бластных клетках.

Форма ядра молодых клеток круглая или слегка вогнутая, у большинства зрелых лейкоцитов (гранулоциты, моноциты) отмечается склонность к ядерному полиморфизму.

Цвета пробирок и вакуумтейнеров

Сиреневая крышка — напыление ЭДТА для общего анализа крови.

Красная крышка — напыление активатор свертываемости для биохимических и иммунологических исследований.

Желтая крышка — фибрин для иммунологических исследований (получение сыворотки).

Голубая крышка — цитрат натрия для коагулограммы (получение плазмы).

Зеленая крышка — гепарин (получение гепаринизированной плазмы).

Серая крышка — напыление для исследований глюкозы и лактата.

Накрытие рабочего стола для подсчета тромбоцитов. Забор крови для подсчета тромбоцитов. Методы подсчета количества тромбоцитов.

Мегакариоцитопоэз: стволовая клетка — мегакариобласт — промегакариоцит — мегакариоцит — тромбоцит.

Доказано, что тромбоциты происходят из цитоплазмы мегакариоцитов (отшнуровка тромбоцитов). Мегакариобласты обнаруживаются в желточном мешке на пятой неделе эмбрионального развития. Мегакариоциты в сосудах на восьмой неделе. Тромбоциты отмечаются в мазках крови на 16 и 21 неделе эмбрионального развития.

Уже на ранней стадии вызревания тромбоцитов электронная микроскопия выявляет признаки дифференциации цитоплазмы. Преобразование мегакариобласта в мегакариоцит длится около 25 часов. Различают как оксифильные (гранулярные), так и базофильные мегакариоциты. Дифференцировка цитоплазмы продолжается и в более зрелых клетках и заканчивается тромобоцитообразованием. Каждый мегакариоцит одномоментно дает от 2000 до 8000 тромбоцитов.

Форма тромбоцитов дисковидная, диаметр от 2 до 5 мкм, толщина до 0,75 мкм. Вне кровяного русла распластываются и выпускают отростки. Норма 180-320*10⁹ в литре. Для анализаторов 200-400*10⁹ в литре.

Исследования циркулирующих тромбоцитов показывают, что размер, плотность, метаболитические, функциональные и биохимические свойства этих клеток заметно отличаются. Эти различия возникают в результате старения клеток в процессе циркуляции. Многообразие тромбоцитов не связано с их старением, а отражает полиморфизм мегакариоцитарного состава костного мозга и вызвано различным соотношением скоростей созревания цитоплазмы.

Среди тромбоцитов принято выделять пять морфологических групп. В основу выделения взяты следующие параметры:

1. Размер пластинок

2. Количественное соотношение между светлой частью пластинок (гиаломером) и темной частью (грануломером).

3. Качественная характеристика грануломера.

4. Качественная характеристика гиаломера.

Группы тромбоцитов:

1. Юные — 3,2%. Диаметр от 3 до 5 мкм, округлая или несколько вытянутая форма, голубовато-сиреневый, яркий гиаломер, светлая зернистость равномерно распределена по всей клетке.

2. Зрелые — 87%. Диаметр от 1,5 до 3 мкм, округлой, реже неправильной формы с псевдоподиями. Гиаломер чаще окрашен в голубой цвет, структура грануломера разнообразна, от отдельных, хорошо различимых гранул, сдвинутых к центру, до единой зернистой массы.

3. Старые — 4,5%. Диаметр от 0,5 до 1,5 мкм. Интенсивно окрашенный, плотный грануломер в виде спаянной темной массы. Гиаломер не виден.

4. Макроформы — 2,8%. Диаметр более 5 мкм, редко до 12 мкм. Вытянутой или округлой формы, чаще с отростками. Голубоватый гиаломер, гранулы равномерно рассеяны по центральной части клетки и не заходят в свободные края.

5. Формы раздражения — 2,5%. Сильно варьируются по размерам, округлой формы. Светлый или почти бесцветный гиаломер с единичными гранулами, сдвинутыми к центру, или вообще не содержат гранул («голубые пластинки»).

Средний объем тромбоцита от 7,4 до 10,4 фенталитров. С возрастом человека объем увеличивается. Светлые тромбоциты функционально более полноценны.

Период созревания тромбоцитов около 8 суток, средняя продолжительность пребывания в кровотоке 9-11 суток. Во время циркуляции в крови тромбоциты занимают центральное или пристеночное положение. В циркулирующей крови находится примерно 67% от всех тромбоцитов и ежедневно разрушается 30-40% и только 5% вследствие старения.