1.4.Примеры трансформации органических соединений

Способность клеток микроорганизмов к сложнейшим процес­сам биотрансформации наиболее полно реализовалась при полу­чении промышленно важных стероидов. Использование абсолют­ной субстратной специфичности и стереоспецифичности биоло­гических катализаторов, присущих целым клеткам микроорганиз­мов, позволило разработать условия осуществления множества химических реакций для структурных перестроек стероидов. В ре­зультате были получены новые соединения с лучшими фармаколо­гическими свойствами.

Биотрансформация стероидов обычно заклю­чается в селективном воздействии на одно из положений стероид­ного скелета. Первый промышленный процесс микробной био­трансформации стероидов основывался на технологии направлен­ного гидроксилирования (11-α-гидроксилирование) прогестерона:

Значимость разработанной микробной трансформации опре­деляется тем, что процессы гидроксилирования кортикостерона и его производных лежат в основе промышленного получения многих ценных продуктов: противовоспалительных и противоопу­холевых препаратов, трансквилизато-ров, анестезирующих средств, половых гормонов и пр.

В качестве типичного примера микробиологической транс­формации рассмотрим подробнее превращение гидрокортизона в преднизолон культурой Mycobacterium globiforme для которой характерны окислительно-восстановительные пре­вращения стероидной молекулы (микроорганизм приме­няется в промышленности для получения стероидных гормонов):

Культуру Mycobacterium globiforme предварительно выращивают на питательной среде содержащей кукурузный экстракт 1,0 г, глюкозу 1 г, агар-агар 3,0 г, на 1 л водопроводной воды при рН сре­ды 6,8-7,2 в течени 4-5 сут. Затем водной суспен­зией клеток засевают колбы с жидкой средой того же состава, раз­литой по 50 мл в медицинские качалочные колбы. Одновременно с бактериальной суспензией вносят в качестве индуктора ацетат кортизона (10 мг в 1 мл метанола на 50 мл среды). Через 24 ч (при сухой биомассе 1,6—2,5 мг/мл) в культуральную жидкость вносят водную суспензию тонкоизмельченного гидрокортизона до величи­ны частиц менее 5мкм. Трансформацию проводят при 28-30 °С на качалке с 200—220 об/мин в течение 18—24 ч. Культуральную жидкость (300 мл) экстрагируют три раза этилацетатом (по 1л), объединенный экстракт упаривают до 300 мл, добавляют 0,3 г акти­вированного угля, кипятят 5-10 мин, уголь отфильтровывают, промывают горячим этилацетатом и растворитель отгоняют до 45 мл. Раствор охлаждают 16 ч при 0 °С для полного выделения преднизолона. Осадок отфильтровывают, промывают охлажден­ным этилацетатом, высушивают при 60-70 °С. Выход преднизо­лона 85 % от теоретического, в качестве примесей образуется 20β-оксипроизводное преднизолона (0,5 %) и исходный гидрокор­тизон – 6-8 %.

При использовании иммобилизованных в полиакриламидный гель клеток Mycobacterium globiforme реакционную смесь, содержащую 0,1 г/л гидрокортизона в фосфатном буфере (рН 7,0), пропускали через колонку, содержащую гранулы геля. Скорость потока через колонку 1,3 мл/ч на 1 мл геля (SV), температура 20-22 °С. Выделение стероидов про­водили по методике, описанной выше. При таких условиях наблюдалось количественное превращение субстрата в течение 9-10 сут, через 15 сут активность снижалась на 50%, через 20 сут обнаруживалось лишь 5-7 % превращенного субстрата.

Разработка крупномасштабного производства преднизолона путем биотрансформации стероидов позво­лила снизить стоимость этого препа­рата в 200 раз.

Важнейший источник стероидных гормонов - культуры кле­ток растений. Так, культура клеток диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoided) корневого происхождения продуцирует фитостерин диосгенин и его гликозидные производные (сапонины). Существенно, что способность к сверхсинтезу фуростаноловых гликозидов ряда штаммов диоскореи, например штамма ДМ-ОГ, ста­бильно поддерживалась в течение 27 лет. Таким образом, культивирование кле­ток растений in vitro представляет со­бой новое решение проблемы про­мышленного получения вторичных метаболитов.

Биотрансформация стероидов с использованием культур растительных клеток имеет целый ряд преимуществ перед микробиологической трансформацией. Так, если трансформация в положения 3 и 5 характерна практически для всех используемых культур (микроорганизмы, растительные клетки), то реакции Iβ-, 4β-, I2β- (дигитоксин в дигоксин), 16β-гидроксилирования и изомеризации 17β-лактонного кольца, осуществляются только некоторыми культурами растительных клеток, и сильно, зависят от проис­хождения ткани и условий трансформации.

Изучение биотрансформации малоиспользуемого в терапии сердеч­ного гликозида дигитоксина в ценные гликозиды (дигоксин, пурпурео-гликозид А и др.) проводилось на клеточных линиях Digitalis. Высокий выход конечных продуктов был достигнут при селекции специализированных линий и оптимизации условий роста в специальных аппаратах.

Процесс биотрансформации ди­гитоксина протекал в две стадии. После 10-дневной инкубации клеток Digitalis lanata в “ростовой” питатель­ной среде (Мурасиге - Скуга) культуру переносили в "продукционную” среду (8% раствор глюкозы) с субстратом для биотрансформации - дигитоксином. В этих условиях весь дигитоксин в течение 2 дней трансформировался в дигоксин.

Дальнейшие успехи в производ­стве стероидных препаратов связы­вают с применением иммобилизо­ванных клеток, использованием оп­тимального сочетания биологических и химических превращений, а также с совершенствованием технологии очистки получаемых соединений.

Так, в настоящее время разработаны промышленные способы получения ценных карденолидов, основанные на иммобилизации растительных клеток Digitalis в специальных биокатализаторах.

В последнее время сильно возрос интерес к использованию микроорганизмов для избирательной биотрансформации гетероциклических соединений.

Среди гетероциклических соединений наиболее широко изучены процессы окисления пиридинов в пиридоны, селективное окисление боковых алкильных групп в различных гетероциклах, энантиоселективное цис-дигидроксилирование бензотиофенов и бензофуранов.

Поразительным примером возможностей микробной биотрансформа-ции является катализируемое ферментами введение аминокислотных фрагментов в 4-, 5-, 6-, 7-азаиндолы при алкилировании их серином.

Учеными фирмы “Сетус корпорепйшин” предложен оригинальный ферментативный способ синтеза различных окисей алкенов (эпоксидов), являющихся исходным соединением для синтеза различных пластмасс и производных диолов (антифриз, тормозная жидкость и т.д). В настоящий момент окиси алкенов получают химическим путем. Процесс протекает под высоким давлением, является взрывоопасным и требует большого количества дорогостоящего серебряного катализатора.

Ферментативный синтез окисей алкенов из алкенов, протекающей в водной среде, основан на 3 ферментах: глюкозозо-2-оксидазе из базидомицета Oudemansiella mucida, галопероксидазе из гриба Caldariomyces или других источников и эпоксидазе из Flavobacterium. На первом этапе синтеза глюкозозо-2-оксидаза вызывает образование перекиси водорода (Н₂О₂) из глюкозы, которая служит и субстратом, и источником энергии. На втором этапе, катализируемом галопероксидазой, перекись водорода взаимодействует с вводимыми в реакционную среду алкеном и галогенид-ионом (ионом фтора, хлора или брома) с образованием соответствующего β-алкангалогенгидрина. На последнем этапе водород гидроксильной (Н⁺) группы и галогенид-анион отщепляются под действием эпоксидазы, в результате чего получается окись соответствующего алкена.

Ферментативный путь синтеза окисей алкенов весьма выгоден с экономической и экологической точек зрения по сравнению с химическим, поскольку источником галогенид-иона может служить обычная соль, такая как хлорид натрия, а в химическом синтезе используют элементарный хлор. Не нужен и серебряный катализатор. При использовании ферментативного метода в качестве побочного продукта с высоким выходом из глюкозы образуется глюконовая кислота, которая в свою очередь является очень ценным продуктам.

Другое преимущество ферментативного способа синтеза окисей алкенов – его гибкость: изменяя субстрат на который действует галопероксидаза, можно синтезировать различные окиси алкенов. Еще одно достоинство этого метода состоит в том, что он не дает отходов: галоген можно опять использовать в новом цикле синтеза. Перспективным является увеличение активности ферментов за счет их иммобилизации или модификации активных центров с использованием методов генной инженерии.