3.2. Рибозимы как лекарственные средства

Рибозимы - это природные РНК, обладающие каталитической активностью (РНК-ферменты); их субстратсвязывающий домен присоединяется к комплементарной РНК-мишени с помощью водородных и, возможно, других связей, а ката­литический “головка молотка” расщепляет ее в специфическом сай­те. Модифицируя субстратсвязываюшую после­довательность, можно получить рибозим, специифичный в отношении определенной мРНК.

Создание «терапевтического» рибозима - сложный процесс. Связано это с трудностью по­лучения больших количеств синтетических РНК и сохранения их в нативном состоянии в клетке-мишени. В одном из экспериментов синтезиро­вали олигодезоксинуклеотид, который содержал каталитический домен (примерно 20 нуклеотидов), фланкированный гибридизующимися с мРНК-мишенью последовательностями (они же выступали в роли праймеров), амплифицировали его, встроили в эукариотический экспрессирующий вектор и трансфицировали полученной конструкцией клетки. Образовавшийся после транскрипции рибозим расщеплял мРНК-мишень и подавлял трансляцию белка, ответствен­ного за развитие того или иного заболевания. Рибозимы, созданные методами генной инже­нерии, можно использовать для лечения рака и вирусных инфекций.

Природных ДНК-ферментов (дезоксирибозимов) пока не обнаружено, но уже синтезиро­ваны олигодезоксинуклеотиды, обладающие ка­талитической активностью. Преимущество дезоксирибозимов состоит в том, что для их по­лучения не нужно использовать экспрессирующий вектор: ДНК-ферменты можно упаковать в липосомы и доставить в клетку-мишень. Одна­ко создание эффективных ДНК-ферментов на­ходится пока на начальном этапе развития.

3.3. Малые интерферирующие рнк.

Разрушение целевой мРНК может происходить также под действием малых интерферирующих РНК (Small interfering RNA, siRNA). Интерференция РНК — одно из новых революционных открытий в молекулярной биологии, а его авторы в 2002 г получили за него Нобелевскую премию. Интерферирующие РНКрезко отличаются по строению от других типов РНК и представляют собой две комплиментарные молекулы РНК длиной примерно в 21-28 азотистых основа­ний, которые соединены друг с другом как нити в молекуле ДНК. При этом по краям каждой из цепей siRNA всегда остается два неспаренных нуклеотида. Воздействие осуществляется следующим образом. Когда молекула siRNA оказыва­ется внутри клетки, она на первом этапе связывается в комплекс с двумя внутриклеточными ферментами - хеликазой и нуклеазой. Этот комплекс получил название RISC (RNA-induced silencing complex; silence - англ. молчать, замолкать; silencing - замолкание, так в англоязычной и специальной литературе называют процесс "выключения" гена). Далее хеликаза расплетает и разъединяет нити siRNA, и одна из нитей (антисмысловая по строению) в комплексе с нуклеазой специфически взаимо­действует с комплементарным (строго соответствующим ей) участком целевой мРНК, что позволяет нуклеазе разрезать ее на две части. Разрезанные участки мРНК далее подвергаются действию других клеточных РНК-нуклеаз, которые доразрезают их на более мелкие куски.

Обнаруженные у растений и низших животных организмов (насекомые) siRNA являются важным звеном своеобразного "внутриклеточного иммунитета ", позволяющего распознавать и быстро уничтожать чужеродную РНК. В том случае, если в клетку проник РНК - содержащий вирус, такая система защиты не даст ему размножиться. Если же вирус содержит ДНК, система siRNA будет мешать ему производить вирусные белки (так как необходимая для этого мРНК будет распознаваться и разрезаться), и с помощью этой стратегии замедлит его распространение по организму. Установлено, что система siRNA отличается чрезвычайной разборчивостью: каждая siRNA будет распознавать и уничтожать только свою, специфическую мРНК. Замена всего лишь одного нуклеотида внутри siRNA ведет к резкому снижению эффекта интерференции. Ни один из блокаторов генов, известных до сих пор, не обладает такой исключительной специфичностью по отношению к своему гену-мишени.

В настоящее время этот метод используется в основном в научных исследованиях для выявления функций различных клеточных белков. Однако потенциально он так же может быть использован и для создания лекарственных препаратов.

Открытие РНК-интерференции дало новую надежду в борьбе со СПИДом и онкологическими заболеваниями. Возможно, применяя терапию siRNA вместе с традиционной антивирусной и противораковой терапией, можно достичь эффекта потенцирования, когда два воздействия приводят к более выраженному лечебному эффекту, чем простая сумма каждого из них, применяемого по отдельности.

Для того, чтобы использовать механизм siRNA - интерференции в клетках млекопитающих для терапевтических целей, внутрь клеток нужно ввести уже готовые двухцепочечные молекулы siRNA. Однако существует целый ряд проблем, которые в настоящее время не позволяют осуществить это на практике, а тем более создать какие то лекарственные формы. Во-первых, в крови на них действует первый эшелон защиты организма, ферменты - нуклеазы, которые разрезают потенциально опасные и необычные для нашего организма двойные цепочки РНК. Во-вторых, несмотря на свое название, малые РНК все же достаточно длинны, а, главное, они несут отрицательный электростатический заряд, что делает невозможным их пассивное проникновение в клетку. И в - третьих, один из самых главных вопросов состоит в том, как заставить siRNA работать (или проникать) только в определенных ("больных") клетках, не затронув при этом здоровых? И, наконец проблема размера. Оптимальный размер таких синтетических siRNA те же 21-28 нуклеотидов. Если увеличить ее длину - клетки ответят выработкой интерферона и снижением синтеза белка. С другой стороны, если попытаться применять siRNA меньшие, чем 21 нуклеотид, резко снижается специфичность ее связывания с нужной мРНК и способность к формированию комплекса RISC. Следует отметить, что преодоление этих проблем критически важно не только для терапии siRNA, но и для генной терапии вообще.

В их решении уже сейчас достигнут некоторый прогресс. Например, ученые пытаются путем химических модификаций сделать молекулы siRNA более липофильными, то есть способными растворяться в жирах, из которых состоит клеточная мембрана, и таким путем облегчить проникновение siRNA внутрь клетки. А чтобы обеспечить специфичность работы внутри только лишь определенных тканей, генные инженеры включают в состав своих конструкций специальные регуляторные участки, которые активизируются и запускают считывание информации, заключенной в подобной конструкции (а значит, и siRNA, если она туда включена), только в клетках определенных тканей.

Так исследователи из Медицинской Школы в Сан-Диего при Калифорнийском Университете (University of California, San Diego School of Medicine) разработали новую эффективную систему доставки малых интерферирующих РНК (siRNA), подавляющих продукцию определенных белков, в клетки. Эта система должна стать основой технологии специфической доставки лекарственных препаратов в различные типы раковых опухолей. «Малые интерферирующие РНК, осуществляющие процесс так называемой РНК-интерференции, обладают невероятным потенциалом для лечения рака», объясняет профессор Стивен Доуди (Steven Dowdy), руководивший исследованием: «и, хотя нам предстоит еще очень много сделать, на данный момент мы разработали технологию доставки препаратов в популяцию клеток – как первичной опухоли, так и метастазов, не повреждая при этом здоровые клетки».

Многие годы Доуди и его коллеги занимались изучением противоракового потенциала малых интерферирующих РНК. Однако обычные siRNA – крохотные отрицательно заряженные молекулы, которые из-за их свойств крайне сложно доставить в клетку. Чтобы добиться этого, ученые использовали короткий сигнальный белок PTD (peptide transduction domain). Ранее с его применением было создано более 50 «гибридных белков», в которых PTD был соединен с белками-супрессорами опухолевого роста.

Однако простое соединение siRNA с PTD не приводит к доставке РНК в клетку: siRNA заряжены отрицательно, PTD – положительно, в результате чего образуется плотный РНК-белковый конгломерат, не транспортирующийся через клеточную мембрану. Поэтому исследователи сначала соединили PTD с белковым РНК-связывающим доменом, который нейтрализовал отрицательный заряд siRNA (получив гибридный белок, названный PTD-DRBD). Такой РНК-белковый комплекс уже без труда проходит через клеточную мембрану и попадает в цитоплазму клетки, где специфически ингибирует матричные РНК белков, активирующих рост опухоли.

Чтобы выявить способность гибридного белка PTD-DRBD доставлять в клетки siRNA, ученые использовали клеточную линию, полученную из рака легких человека. После обработки клеток PTD-DRBD-siRNA было обнаружено, что наиболее восприимчивыми к siRNA являются клетки опухоли, в то время как в нормальных клетках (в качестве контроля использовались Т-клетки, эндотелиальные клетки и эмбриональные стволовые клетки), где не происходило повышенной продукции онкогенных белков, токсических эффектов не наблюдалось.

Данный метод можно подвергать различным модификациям, используя разные siRNA для подавления разных опухолевых белков – не только продуцирующихся в излишнем количестве, но и мутантных. Также возможно модифицировать терапию в случае рецидивов опухолей, которые обычно за счет новых мутаций становятся невосприимчивыми к химиотерапевтическим препаратам.

Онкологические заболевания очень вариабельны, а молекулярные характеристики белков опухолевых клеток индивидуальны для каждого пациента. Авторы работы считают, что в данной ситуации применение малых интерферирующих РНК – наиболее рациональный подход к терапии.