1.2.Культивирование протопластов

Для культивирования протопластов используются два методических приема: инкубирование в каплях жидкой среды и помещение в агаровый слой. Естественно, что каждый из них имеет свои преимущества и свои недостатки.

В первом случае обеспечивается хороший обмен газами через воздушную фазу и легкая диффузия в раствор выделяемых продуктов обмена. Помимо этого, к растущим протопластам можно легко добавлять свежую питательную среду в желаемых концентрациях. Однако при этом способе протопласты имеют тенденцию агрегировать в центре капли, что препятствует наблюдению за судьбой индивидуальных колоний протопластов.

В соответствии со вторым методом определенный объем взвеси протопластов в жидкой среде добавляется к равному объему 1%-ной расплавленной и охлажденной агаризованной среды того же состава. После уплотнения (затвердевания) среды протопласты оказываются разобщенными друг от друга и фиксированными в одном положении, что обеспечивает наблюдение за развитием индивидуальных протопластов – формирование клеточной стенки, деление клеток и дальнейшие превращения. Недостатком метода является возможность механического повреждения протопластов при смешивании с агаром, а также температурные воздействия расплавленной среды при ее недостаточном охлаждении.

Существуют различные усовершенствованные модификации описанных выше методов культивирования протопластов. Удобным методом является культивирование протопластов в малом объеме жидкой питательной среды (до 1 мкл), метод получил название микроизоляции отдельных протопластов.

Очень важной проблемой клеточной инженерии растительных организмов является регенерация протопластов. Синтез клеточной стенки у образовавшихся протопластов практически начинается сразу после удаления раствора ферментов, вызвавших ее деструкцию, что можно относительно легко наблюдать с помощью флюоресцентного микроскопа. Для предотвращения преждевременной регенерации в питательную среду вводят кумарин в концентрации 200-250 мг/л. Если регенерация клеточных стенок – процесс достаточно распространенный у протопластов, то добиться деления сформировавшихся из протопластов клеток значительно труднее, а еще труднее получение из растительных протопластов целых растений.

Возможность регенерации растений из протопластов,обнаруженная в 1970 г, является свидетельством сохранения у них свойства тотипотентности. Регенерация растений осуществляется либо посредством эмбриогенеза, либо в процессе развития каллуса с последующей индукцией морфогенеза, посредством подбора оптимальных уровней гормонов, стимулирующих соответствующие этапы эмбриогенеза или морфогенетического процесса

1.3.Слияние протопластов

Некоторые изолированные протопласты за тот короткий промежуток времени, пока они не образуют клеточную стенку, могут сливаться друг с другом, т.е. ведут себя подобно половым клеткам. Такое слияние является спонтанным и происходит чаще, если используются протопласты, полученные из молодых тканей или из суспензионных культур клеток. Однако этот процесс может быть стимулирован путем добавления определенных веществ, что позволяет осуществить слияние не только протопластов одного вида, но и гетерологичных (парасексуальная гибридизация). Таким способом удалось даже получить регенерированное растение после слияния протопластов растения табака двух видов.

Довольно эффективным индуцирующим слияние протопластов агентом оказался полиэтиленгликоль (ПЭГ), обеспечивающий сильную адгезию протопластов. С его помощью были получены гибриды протопластов растений и животных клеток, протопласты растений и водорослей. Недостатком данной техники является то, что с ее помощью не удается получить большое количество слившихся протопластов за один прием. Другим способом стимулирования слияния является электропорация – кратковременная обработка культуры протопластов электрическими импульсами высокого напряжения. При всех методах на первом этапе происходит агрегация протопластов вследствие, как полагают, изменений их поверхностного потенциала. Последующее воздействие индукторов слияния сводится к определенным изменениям структуры мембран, увеличивающим их слипаемость и текучесть. Слияние, индуцируемое электрическими импульсами, возникает, вероятнее всего, в результате диэлектрического разрушения (пробоя) соприкасающихся участков мембран протопластов. Вокруг возникающей «дырки» возможен обмен молекулами липидов с образованием липидных мостиков, что, в конечном счете, приводит к слиянию мембран, поскольку возникает энергетически более выгодное состояние, нежели при наличии двух поврежденных мембран.