2.2. Факторы, влияющие на продуктивность культур тканей

Способность культур тканей растений к синтезу и накоплению вторичных метаболитов является установленным фактором. Однако для многих культур до сих пор не удается определить условия накопления продуктов, хотя бы в количествах, характер­ных для родительских растений. Как правило, клеточные культуры, напрямую полученные из растений, характеризуются низким содержанием искомых веществ. Это связано с тем, что в растениях обычно синтез и накопление вторичных метаболитов разобщены во времени и происходят в разных органах или тканях, а синтез их в недифференцированных тканях сильно репрессирован или вообще невозможен. Толь­ко благодаря использованию методов селекции и правильно разработанной технологии культивирования высоко­производительных штаммов к настоящему времени получены культуры тканей, в которых содержание вторичных продуктов достаточно ве­лико, чтобы их получение было рентабельным с экономической точки зрения.

На выход вторичных продуктов в культуре ткани могут влиять следую­щие факторы.

2.2.1. Происхождение ткани

Обычно в качестве источника клеток для получения культуры ткани проводят поиск наиболее продуктивных растений в надежде, что эта способность будет пере­несена и в культуру. Однако однозначной зависимости между продукционной способностью растения и клеточной культуры, полученной из него обычно не наблюдается. Например, куль­туры тканей Catharanthus roseus, полученные из высокоалкалоид­ных растений, проявляли тенденцию к синтезу большего количества алкалоидов, чем культуры, полученные от малопродуктивных растений. В то же время клеточные культуры Duboisia myoporoides растения, наиболее богатого тропановыми алкалоидами (5,0%), не накапливали значительных количеств алкалоидов. Наибольшее содержание тропановых алкалоидов отмечено в культуре ткани Hyoscyamus niger (0,01-0,02%), хотя растение не отличается высокой алкало­идной продуктивностью. Как известно, коробочки Papavеr somniferum не является источником сырья для получения алкалоида сангвинарина. Но в культуре ткани этого растения под влиянием элиситоров накапливается 2.9% сангвинарина. Клетки Cinchona ledgeriana в культуре ткани накапливают главным образом антрахиноны, а не алкалоиды.

2.2.2. Клеточная дифференциация in vitro.

В настоящее время большое число экспериментальных данных сви­детельствует о том, что образование и накопление вторичных про­дуктов в растениях - сложный, пространственно и повременно организованный про­цесс, который часто в той или иной форма включает транспорт этих соединений на клеточном и субклеточном, уровнях. В целом ряде слу­чаев показано резкое разграничение мест первичного синтеза и на­копления алкалоидов. Установлено, что, эти два процесса могут быть локализованы в различных клетках в пределах одного и того, же органа или даже одной и той же ткани.

Известно, например, что люпиновые алкалоиды в растениях сем. Leguminosae синтезируются в зеленых частях растений, а накапливаются в корнях. Тропановые алкалоиды синтезируются в корнях, а затем транспортируются в стебли.

В культурах тканей растений, также как и в растениях, накоп­ление вторичных метаболитов зачастую тесно связано с процессом вторичной тканевой дифференциации. В таких культурах обычно наблюдается формирование сек­реторные канальца, млечники, слизевые клетки, железки или специ­ализированные клетки, где накапливаются конечные продукты, т.е. происходит процесс разобщения синтеза и накопления вторичных ве­ществ. В недифференцированных клетках и тканях синтез таких продуктов сильно репрессирован.

Установлено, например, что практически все клетки в каллусе Macleya microcarpa обладают способностью синтезировать изохиноликовые алкалоиды, однако их накопление осуществлялось лишь в специализированных, так называемых "алкалоидных" клетках.

Исследователи, работающие с культурами тканей, неоднократно на­блюдали, что при образовании в каллусной ткани морфологических структур (побегов, корней, эмбриоидов и т.д.) содержание искомых продуктов в культуре увеличивается. Например, культура ткани Atroра belladonna при недифференцированном росте не продуцировала гиосциамин, а при образовании корней в каллусе, начинается синтез ал­калоида. Сердечные гликозиды наперстянки синтезировались только при образовании в культуре ткани эмбриоидов.

Существенным диагностическим признаком культуры ткани раувольфии змеиной является наличие выделительных образований с различ­ной степенью морфологической специализации: клетки-идиобласты и удлиненные секреторные образования типа млечников. Микрохимический и люминесцентный анализ показал, что основная масса алкалоидов на­ходится в этих структурных образованиях, причем максимальное со­держание алкалоидов наблюдается в период увеличения количества сек­реторных идиобластов и образований типа млечников. В растени­ях рода раувольфия наивысшее содержание алкалоидов также отмечает­ся в аналогичных секреторных структурах - идиобластах и млечниках.

Индукция морфогенеза в культуре ткани Papaver bracteatum при­вела к появлению алкалоидов тебаина и морфина, тогда как недиффе­ренцированные каллусные ткани накапливали сангвинарин и допамин.

Быстрое увеличение содержания лимонена и нарингенина наблюда­лось в процессе образования побегов в культуре тканей видов Citrus, что свидетельствует о корреляции их биосинтеза с клеточной дифференци­ацией.

Интерес представляют процессы цитодифференцировки, происходя­щие в тканях Catharanthus roseus при переносе их из "ростовой среды" в "продукционную". В цитоплазме паренхимных клеток при вы­ращивании их в течение двух недель на "алкалоидпродуцирующей" сре­де появлялись большие липидные капли, что коррелировало с накоп­лением алкалоидов.

Обнаружена четкая корреляция между ультраструктурной органи­зацией пластид (хлоропластов и этиопластов) и биосинтетической способностью каллусных культур чайного растения, что подчеркивает важную роль хлоропластов в образовании фенольных соединений. С наличием развитых хлоропластов в растущей на свету культуре тка­ни Lupinus polyphyllus также связано увеличение (в 10 раз) обра­зования хинолизидиновых алкалоидов лупинана и спартеина.

Ультраструктура клеточных линий Coptis japonica, продуциру­ющих алкалоиды типа протоберберина существенно отличалась от кле­точных линий, неспособных к синтезу алкалоидов: в продуцирующих алкалоиды клетках перед началом синтеза алкалоидов обнаружен боль­ший объем вакуолей, чем в непродуцирующих клетках. Кроме того, в продуцирующих клетках можно было наблюдать многочисленные везику­лы, содержащие в цитоплазме плотный осадок.