Лекция №13 Использование рекомбинантных микроорганизмов для получения коммерческих продуктов небелковой природы.

Помимо получения белковых продуктов достижения генной инженерии можно использовать для крупномасштабного производства различных ценных низкомолекулярных небелковых соединений – витаминов, аминокислот, антибиотиков и др.

Используя технологию рекомбинантных ДНК, можно направленно изменять метаболизм мик­роорганизмов, вводя в них новые гены или мо­дифицируя уже существующие. Основной це­лью таких изменений является создание рекомбинан-тного микроорганизма с новой фер­ментативной активностью, способного превра­щать существующий субстрат в ценный про­дукт, который обычно получают только сочетанием химических и микробиологических методов.

1.Синтез l-аскорбиновой кислоты

В настоящее время для крупномасштабного про­изводства L-аскорбиновой кислоты (витамина С) используют весьма трудоемкий процесс, включа­ющий одну микробиологическую стадию и не­сколько химических; исходным субстратом для него является D-глюкоза (рис.4). На послед­нем этапе этого процесса 2-кето-L-гулоновая ки­слота (2-KLG) превращается в кислых условиях в L-аскорбиновую кислоту. Биохимические ис­следования метаболизма различных микроорга­низмов показали, что 2-KLG можно получить другим путем. Так, одни бактерии (Acetobacter, Gluconobacter и Erwinia) могут превращать глю­козу в 2,5-дикето-О-глюконовую кислоту (2,5-DKG), а другие (Corynebacterium, Brevibacterium и Arthrobacter), синтезирующие фермент 2,5-DKG-редуктазу, - преобразовывать 2,5-DKG в 2-KLG.

Использующийся в настоящее время комбинированный способ получения аскорбиновой кислоты можно было бы существенно усовершенствовать, заменив большинство химических стадий на одну микробиологическую. Эта стадия включала бы в себя совмест­ное культивирование указанных микроорганиз­мов для превращения глюкозы в 2-KLG. К сожалению, такое культивирование имеет свои трудности, поскольку эти микроор­ганизмы могут иметь разные оптимумы темпе­ратуры и рН, могут различаться также состав среды и скорость роста. Иными словами, усло­вия культивирования, оптимальные для одного организма, могут быть неприемлемы для другого, что приведет к спонтанному «вымыванию» из среды одного из них.

В принципе можно культивировать каждый из микроорганизмов в отдельных последователь­но расположенных ферментерах, однако такой процесс трудно будет сделать непрерывным, если для роста микроорга­низмов необходимы существенно разные среды. Поэтому наилучшим выходом из этой ситуации было бы создание одного микроорганизма, синтезирую­щего все ферменты, необходимые для превраще­ния глюкозы в 2-KLG. Erwinia herbicola осущест­вляет превращение D-глюкозы в 2,5-DKG в несколько стадий, катализируемых разными ферментами, в то время как Cotynebacterium sp. для превращения 2,5-DKG в 2-KLG необходима только одна стадия. Следовательно, наиболее простой способ создания одного микроорганиз­ма, способного превращать D-глюкозу в 2-KLG, состоит в выделении гена 2,5-ОКС-редуктазы Corynebacterium sp. и введении его в Erwinia her­bicola

После получения такие трансформированные клетки Erwinia актив­но превращали D-глюкозу непосредственно в 2-KLG, при этом собственные ферменты Erwinia, локализованные во внутренней мембране бакте­риальной клетки, преобразовывали глюкозу в 2,5-DKG, а 2,5-DKG-редуктаза, локализован­ная в цитоплазме, катализировала превращение 2,5-DKG в 2-KLG (рис.6). Таким образом, с помощью генетических манипуляций метаболи­ческие реакции, протекающие в столь разных микроорганизмах, удалось осуществить в одном из них. Этот гибрид приобрел способность син­тезировать конечный продукт комбинирован­ного метаболического пути. Такой организм можно использовать как фабрику для производ­ства 2-KLG, заменяющую первые три стадии в том процессе получения L-аскорбиновой кислоты, который используют в настоящее время.