2.2.5.Физические факторы, влияющие на развитие клеточных культур.

На рост и развитие растительных тканей in vitro, а так же на синтез ими вторичных метаболитов большое влияние оказывают физические факторы - свет, температура, аэрация.

Свет. Большинство каллусных тканей могут расти в условиях слабого освещения или в темноте, так как их клетки лишены хлоропластов и не способны к фотосинтезу. Вместе с тем свет может выступать как фактор, обеспечивающий морфогенез и активирующий или подавляющий процессы синтеза вторичных метаболитов. Решающее значение могут иметь такие характеристики света как его мощность и длина волны. В качестве источника света обычно используют люминесцент­ные лампы дневного света. Так, в культурах чайного растения под действием света увеличивался биосинтез полифенолов. Напротив, в культуре клеток Scopolia parviflora свет подавлял образование алкалоидов. Кроме интенсивности освещенности на культуру ткани и ее физиологические особенно­сти влияет качество света, т.е. длина световой волны. Так, более 20 флавонов и флавоноловых гликозидов образуется в культурах клеток петрушки после освеще­ния ее непрерывным люминесцентным светом «холодный белый». Вместе с тем синтез флавоновых гликозидов активируется при по­следовательном облучении ультрафиолетовым светом, а затем све­том, лежащим в области «красный - длинноволновый красный». Такая зависимость биосинтеза тех или иных соединений от длины волны может быть объяснена тем, что некоторые химические реакции, протекающие в клетках являются фотоиндуцируемыми, т.е. происходят только после того как с поглощенным светом они получают вполне определенное количество энергии.

Температура. Для большинства каллусных культур оптимальна температура 26 "С. В то же время каллусы и культуры клеток диоскореи дельтовидной хорошо растут даже при температуре 32°С. В отличие от роста культур клеток и тканей, индукция их морфоге­неза требует более низких температур (18 - 20°С). Влияние тем­пературы на метаболизм клеток in vitro изучено слабо. Есть дан­ные, что в каллусных культурах максимальное образование алка­лоидов наблюдалось при температуре 25°С, а при повышении тем­пературы резко снижалось. В суспензионных культурах клеток Ipomoea содержание жирных кислот значительно увеличивалось, если их выращивали при субоптимальных температурах роста (15°С). Поэтому при выращивании культуры in vitro необходимо тща­тельно изучать влияние всех абиотических факторов, в том числе температурного, на рост и метаболизм клеток.

Аэрация. Для выращивания суспензионных культур большое значение имеет аэрация. Особенно важно снабжение воздухом куль­тивируемых клеток в больших объемах ферментеров.

При сравнении разных типов ферментеров было показано, что синтез вторичных метаболитов в суспензионной культуре был наи­большим при подаче воздуха снизу. При выращивании клеток в малых объемах (в колбах) нормальная аэрация достигается при постоянном перемешивании суспензии.

2.2.6. Химические факторы, влияющие на синтез вторичных метаболитов.

Образование вторичных продуктов в культу­ре ткани растения может резко возрастать под влиянием некоторых стрессо­вых факторов (наличия веществ - продуктов жизнедеятельности определенных микроорганизмов, токсичных ионов тяжелых металлов, осмотического шока и т.д.).

Вторичные продукты некоторых растений, и прежде всего алкалоиды, являются фитоалексинами, т.е. их синтез в растительной клетке происходит в ответ на наличие или воздействие продуктов жизнедеятельности патогенных микроорганизмов. Таким образом растение защищает себя от фитопатогенов. Поэтому при добавлении к культуре ткани элиситоров (гомогенат из грибного мицелия или какие-либо другие продукты жиз­недеятельности микроорганизмов, паразитирующих на этих растениях в природе) возрастает интенсивность синте­за некоторых ценных веществ.

Так культура ткани Cephalotaxus harringtonia, продуцировавшая в небольших количествах цефалотоксин и противоопухолевый алка­лоид гомохаррингтонин, при добавлении к ней автоклавированных конидий гриба Verticillium dabiae в течение 6-8 дней значи­тельно увеличивала содержание этих алкалоидов.

Клетки Catharanthus roseus после обработки в течение 18 ча­сов гомогенатом гриба Pythium aphanidermatum (5%) увеличили биосинтез катарантина (до 0,01% от массы сухой ткани) в фермен­тере вместимостью 7,5 л. Усиление образования катарантина происходило в течение 1-2 дней после обработки элиситором и глав­ным образом в клетках, закончивших рост.

Биосинтез бензофенантридиновых алкалоидов в суспензионной культуре Eschscholtzia californica был индуцирован после обра­ботки ее элиситором, приготовленным из дрожжевого экстракта.

Институт биотехнологии (Канада, г.Саcкачеван) с целью умень­шения себестоимости конечного продукта предложил промышленный способ получения сангвинарина из клеточных культур мака путем элиситации продуцентов алкалоида грибным гомогенатом из Pythium aphanidermatum.

Кроме элиситоров грибного и микробного происхождения биосин­тез вторичных продуктов могут стимулировать химические вещества. Так, клетки Lithospermum erythrorhizon после переноса в продук­ционную среду, содержащую в 30 раз больше CuS0₄, чем ростовая среда, резко усилили синтез красителя шиконина. По-видимому, высокая концентрация СuSO₄ вызвала стресс, что индуцировало усиленное об­разование шиконина. Было показано, что накопление изофлавоновых гликозидов в суспензионных культурах Vigna angularis стимулируется обработкой ее ванадатом натрия. Установлено, что сульфат ванадия способствовал увеличению почти в 2 раза содержания индольных алкалоидов аймалицина и катарантина в культивируемых клетках Catharanthus roseus. В настоящее время не известен ни механизм воздействия VaS0₄ на синтез вторичных продуктов, ни место его аккумуляции. Тем не менее, обработка клеток солями ванадия способствовала сокращению периода роста, увеличению выхода индольных алкалоидов и в отличие от грибных элиситоров не требовала выращивания грибов и получения из них элиситора. Этот способ может быть с успехом использован для получения ценных продуктов жизне­деятельности растительных клеток.