9. Методы изучения гуморальных факторов видового иммунитета.

Исследование системы комплемента представляет собой существенную проблему в силу особенностей ее структурно-функциональной организации, включающей компонентный состав системы и каскадный механизм вовлечения компонентов в реакцию активации.

1. Исследование концентрации отдельных компонентов системы комплемента в иммунохимическом анализе (иммуноэлектофорез, радиальная иммунодифузия, нефелометрия, радиоиммунные, иммунофлюориметрические и иммуноферментные методы).

2. Исследование функциональной активности классического, альтернативного путей активации системы комплемента, а также отдельных компонентов системы с помощью гемолитических методов.

3. Исследование количества биологически активных фрагментов компонентов комплемента, образующихся при активации системы по классическому или альтернативному пути в радиоиммунном анализе.

10. Клеточные факторы видового иммунитета. Эффекторные клетки, обеспечивающие видовой иммунитет. Морфофункциональные особенности нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, тучных клеток, моноцитов и макрофагов. Биологическая целесообразность фагоцитарного процесса, дистантного и контактного киллинга.

К клеточным факторам (механизмам) относятся реакции: фагоцитоза и цитотоксичности (килинга).

Объекты, в отношении которых осуществляются данные реакции, называются мишеними, а клетки, осуществляющие их – эффекторными клетками, или эффекторами.

Вариативность реакции обусловлена разнообразием структурно-функциональной организации чужеродных агентов и других объектов, подлежащих уничтожению в рамках видового иммунитета.

Среди факторов организации объектов, подлежащих уничтожению, особое значение имеют размеры объекта относительно размеров эффекторных клеток и его внеклеточное или внутриклеточное расположение.

Реакции фагоцитоза осуществляются специализированными клетками – фагоцитами (нейтрофилы и макрофаги) в отношении объектов размеры которых значительно меньше размеров фагоцитов.

Цитотоксические реакции осуществляются специализированными клетками – лимфоцитами – естественными киллерами, а также другими типами клеток: эозинофилами, тучными клетками (базофилами) в отношении объектов, размеры которых сравнимы или превышают размеры эффекторной клетки.

Нейтрофилы – гранулярные лейкоциты 10-12 мкм в диаметре. Являются самой многочисленной группой лейкоцитов и представлены клетками с разным уровнем дифференцировки. Юные нейтрофилы имеют ядро бобовидной формы со светлым содержимым. Палочкоядерные нейтрофилы имеют ядро в виде палочки или подковы, с большим содержанием гетерохроматина. Сегментоядерные нейтрофилы – наиболее зрелые формы, содержат дольчатое ядро, состоящее из 2-5 сегментов, соединенных перетяжками.

В процессе дифференцировки нейтрофилов, кроме сегментации ядра происходит накопление гликогена, уменьшение органелл синтетического аппарата и накопление гранул:

а) первичные (азурофильные, неспецифичные) – аналоги лизосом содержат катепсин – антимикробное вещество с широким спектром действия; лизоцим – фермент, разрушающий клеточную стенку бактерий; эластазу и коллагеназу, которые разрушают эластин и коллаген тканей нейтрофилов; пероксидазу – значительно усиливает активность антимикробных ферментов и т.д.

б) вторичные (специфические) гранулы содержат адгезивные белки, обеспечивающие адгезию нейтрофилов на эндотелиоцитах; лактоферрин, связывающий факторы роста бактерий, коллагеназу, лизоцим.

Нейтрофилы передвигаются в тканях путем хемотаксиса, по градиенту концентрации веществ, образующихся при расщеплении микроорганизмов. Факторами хемотаксиса служат вещества, выделенные активированными нейтрофилами и другими клетками (тучными, макрофагами).

Функции нейтрофилов:

1) Повреждающее воздействие на микробы (катепсин, лизоцим и др.);

2) Фагоцитоз микроорганизмов, поврежденных клеток – одна из основных функций нейтрофилов, поэтому их еще называют микрофагами;

3) Участие в специфических иммунных реакциях: вырабатывают биологически активные вещества (цитокины) и регулируют кооперацию клеток при иммунном ответе.

Эозинофил – гранулярный лейкоцит 12-17 мкм в диаметре, содержит палочковидное или сегментированное (обычно два сегмента с перемычкой) ядро, хорошо развитые органеллы в цитоплазме и гранулы. Из кровотока мигрируют в основном в рыхлую соединительную ткань органов, контактирующие с внешней средой (слизистая дыхательных, мочеполовых путей, кишечника). В рыхлой соединительной ткани эозинофилов в 200 раз больше, чем в крови.

В цитоплазме содержатся гранулы двух типов:

а) неспецифические (аналогичные у нейтрофилов) и

б) специфические – овоидной (яйцевидной) формы, содержат кристаллоид, образованный главным основным белком (обусловливает эозинофилию). Обладает мощным противогельминтозным, противопротозойным и антимикробным действием. В аморфном матриксе, расположенном по периферии от кристаллоида содержатся фермент гистаминаза, иннактивирующий гистамин, а также коллагеназа и другие биологически активные вещества. Эозинофилы способны к хемотаксису. Факторами хемотаксиса являются паразиты и продукты их жизнедеятельности, вещества, выделяемые лимфоцитами, макрофагами, тромбоцитами, эндотелиоцитами. Особенно эффективен гистамин тучных клеток.

Функции эозинофилов:

1) инактивация гистамина ферментом гистаминазой,

2) уничтожение паразитов (гельминтов и простейших) нефагоцитарным путем.

2) Фагоцитоз.

3) Ограничивают область иммунной реакции, создавая препятствие распространению антигенам и медиаторам воспаления, разрушая их.

Базофил – гранулярный лейкоцит 10-12 мкм в диаметре, аналогичный тучной клетке, но отличаются друг от друга по соотношению и составу гранул. Базофил содержит S — образное трехдольное ядро, слабооксифильную цитоплазму, в которой находятся все органеллы в умеренном количестве, липидные капли, гликоген и два типа гранул:

1)неспецифические азурофильные – аналогичны лизосомам;

2) специфические гранулы – плотные гранулы округлой или овальной формы, содержащие гепарин – антикоагулянт, гистамин – вещество, расширяющее сосуды, увеличивающее их проницаемость, а также факторы хемотаксиса нейтрофилов и эозинофилов и другие факторы.

Функции базофилов:

1) Участие в защитных реакциях организма (в первую очередь при аллергических и воспалительных реакциях): базофилы выделяют локально в большом количестве биологически активные вещества гранул, привлекают ряд других клеток (эозинофилы, нейтрофилы и др.).

Моноциты – агранулярные лейкоциты диаметром 18-20 мкм. В крови находятся транзитом по пути следования в органы и ткани, где будут функционировать, из красного костного мозга. Совокупность всех потомков моноцитов крови в тканях называетсясистемой мононуклеарных (одноядерных) фагоцитов: макрофаги (гистиоциты) соединительной ткани, дендритные клетки кроветворных органов, альвеолярные макрофаги легких, селезенки и красного костного мозга, макрофаги (клетки Купфера) печени, остеокласты костной ткани, перитонеальные макрофаги, макрофаги (клетки Хофбауэра) плаценты и  микроглия нервной ткани.

Моноцит имеет крупное, эксцентрично расположенное бледное ядро с выемкой, которая увеличивается по мере созревания клетки. В слабобазофильной цитоплазме содержится большое количество лизосом и вакуолей, рибосом и полирибосом, умеренное количество цистерн грЭПС и хорошо развитый аппарат Гольджи, цитоскелет, мелкие удлиненные митохондрии. Имеются центриоли.

Функции моноцитов:

1) фагоцитоз и эндоцитоз;

2) участие в кооперации клеток при иммунном ответе, являясь антиген представляющими клетками, а также выделяют биологически активные вещества, регулирующие гемопоэз и хемотаксис других участников иммунных реакций.

Тучные клетки (мастоциты, лаброциты) — высокоспециализированные иммунные клетки соединительной ткани аналоги базофилов крови. Участвуют в адаптивном иммунитете. Тучные клетки рассеяны по соединительной ткани организма, особенно под кожей, вокруг лимфатических узлов и кровеносных сосудов; содержатся в селезенке и костном мозге.

Тучные клетки играют важную роль в воспалительных реакциях, в частности, аллергических реакциях. Так же как и у базофилов, поверхность тучных клеток имеет рецепторы для иммуноглобулинов IgE.

Тучные клетки содержат большое количество цитоплазматических гранул, окрашиваемых катионными красителями. Гранулы включают протеогликаны (гепарин), гистамин, интерлейкины и нейтральные протеазы. При активации (например, при аллергической реакции) тучные клетки высвобождают содержимое гранул в окружающую ткань (дегрануляция). В процессе дегрануляции выделяется гепарин, препятствующий свёртыванию крови. Секреция гистамина, напротив, происходит без нарушения целостности клеточной оболочки и гранул. Выход этих веществ приводит к изменению состояния межклеточного вещества соединительной ткани, гематотканевого барьера.

Мононуклеарные фагоциты (макрофаги) составляют наиболее важную группу способных к фагоцитозу долгоживущих клеток.

Тканевые макрофаги и их предшественники моноциты , промоноциты и монобласты - образуют систему мононуклеарных фагоцитов .

Макрофаги - это долгоживущие фагоциты , имеющие много общих функций с нейтрофилами . Кроме того, макрофаги в качестве секреторных клеток участвуют во многих сложных иммунных и воспалительных реакциях, в которых не участвуют нейтрофилы.

Моноциты, как и нейтрофилы, покидают сосудистое русло путем диапедеза , но дольше циркулируют в крови: их период полуциркуляции составляет от 12 до 24 ч. После того как моноциты попадают в ткани, они превращаются в макрофаги, выполняющие специфические функции в зависимости от анатомической локализации. Особенно богаты этими клетками селезенка, печень, костный мозг и легкие , где функция макрофагов состоит в удалении из крови микроорганизмов и других вредных частиц.

Макрофаги - долгоживущие клетки с хорошо развитыми митохондриями и шероховатым эндоплазматическим ретикулумом.

Роль макрофагов в иммунитете исключительно важна - они обеспечивают фагоцитоз, переработку и представление антигена T-клеткам.

Основная функция макрофагов сводится к борьбе с теми бактериями, вирусами и простейшими, которые могут существовать внутри клетки-хозяина, при помощи мощных бактерицидных механизмов, которыми обладают макрофаги.

Таким образом, макрофаги являются одним из орудий врожденного иммунитета. Кроме того макрофаги наряду с B- и T-лимфоцитами участвуют и в приобретенном иммунном ответе , являясь "дополнительным" типом клеток иммунного ответа: макрофаги являются фагоцитирующими клетками, чья функция - "проглатывание" иммунногенов и процессирование их для представления T-лимфоцитам в форме, пригодной для иммунного ответа.

При аутоиммунных заболеваниях макрофаги удаляют из крови иммунные комплексы и другие иммунологически активные вещества.

Макрофаги участвуют в заживлении ран, удалении отживших клеток и образовании атеросклеротических бляшек.

Лимфоциты – агранулярные лейкоциты диаметром 5-10 мкм, представлены большой группой морфологически сходных, но функционально различных клеток. Рециркуляция – способность лимфоцитов выходить из крови в ткани, затем снова возвращаться в кровь через лимфу. В крови находится лишь 2% лимфоцитов, 98% рассредоточено по другим органам и тканям. Лимфоциты – округлые клетки с крупным ядром, занимающим до 90% объема клетки. Цитоплазма слабобазофильная. Все органеллы представлены в умеренном количестве, кроме цитоскелета, который хорошо развит.

Виды лимфоцитов: 1) по размерам клетки различают: малые (6-7мкм), их 80-90% от общего количества лимфоцитов крови; средние (8-9 мкм) – 10% и большие (10-18 мкм) – в норме в крови отсутствуют. 2) по функции выделяют Т- и В-лимфоциты.

Отличия Т- и В-лимфоцитов:

- по месту антигеннезависимой дифференцировке: Т-лимфоциты в тимусе, В-лимфоциты в лимфоидной ткани других органов.

- по выполняемым функциям: Т-лимфоциты обеспечивают преимущественно клеточный иммунитет, В-лимфоциты – гуморальный иммунитет. Функционально Т- и В-клетки делят на субпопуляции. Среди Т-лимфоцитов выделяют Т_х (хелперы) – активируют эффекторные клетки, Т_к (киллеры) – эффекторные цитотоксические клетки, Т_с (супрессоры) – подавляют иммунный ответ, Т-лимфоциты памяти.

В-лимфоциты дифференцируются в плазматические клетки, вырабатывающие иммуноглобулины (антитела) и в клетки памяти, несущие информацию о встрече с каким- либо антигеном.

- по содержанию в крови: Т-лимфоцитов – 70-80%, В-лимфоцитов — 10-20%.

Функция лимфоцитов: 1) участие и обеспечение иммунных реакций.

11. Фагоцитарный процесс: этапы развития. Исходы фагоцитоза. Различия фагоцитоза, обеспечиваемого нейтрофилами и макрофагами. Механизмы внутриклеточного киллинга в процессе фагоцитоза (кислородзависимые и кислороднезависимые).

Фагоцитоз – это реакция поглощения объекта клеткой-фагоцитом с последующим внутриклеточным уничтожением объекта.

Различают 2 типа фагоцитов: нейтрофилы и макрофаги. Они относятся к профессиональным фагоцитам и это их главная функция.

Нейтрофилы и макрофаги различаются по многим параметрам:

1. Основное место пребывания нейтрофилов - кровеносное русло, в капиллярах сети они получают возможность выхода в ткань при необходимости.

Макрофаги образуются из моноцитов, которые циркулируют по кровеносному руслу. Для фагоцитоза моноциты не развиты, но выходя в ткань моноциты превращаются в тканевые макрофаги. Тканевые макрофаги разных тканей образуют особую стационарную популяцию макрофагов, которые имеют свое название: макрофаги печени - клетки Купффера, нервной ткани - микроглия, костной ткани - остеокласты, легких - альвеолярные макрофаги.

2. Нейтрофилы и макрофаги могут фагоцитировать разные объекты. Нейторфилы непатогенных и условно патогенных, а макрофаги еще и облигатно патогенных.

3. Нейтрофилы выполняют функцию фагоцитоза 1 раз в жизни и в результате происходит не только деструкция но и гибель фагоцита.

Макрофаги способны к многократному повтору фагоцитоза. Считается, что продолжительность жизни тканевых макрофагов не исчисляется месяцами и даже годами.

4. У нейтрофилов отсутствует способность восстанавливать цитоплазматическую мембрану.

5. Различия в продолжительности фагоцитоза. У макрофагов фагоцитоз до 2 часов, у нейтрофилов до часа.

6. Фагоцитоз нейтрофилов заканчивается деструкцией объекта, а макрофаги инициируют дальнейшее развитие антиген-специфичного иммунного ответа. Макрофаги обладают выраженной биосинтетической и синтетической активностью. Они способны продуцировать компоненты системы комплемента, цитокины, медиаторы воспаления.

Основные отличия фагоцитов - макрофагов и нейтрофилов

Признак	Нейтрофилы	Моноциты/макрофаги
Время жизни	часы	в крови - несколько суток, в тканях - длительное время
Способность к делению	отсутствует	тканевые макрофаги способны к делению
Синтетические способности	зрелые нейтрофилы не способны к синтезу	высокая биосинтетическая активность
Способности к репарации мембраны и др. клеточных структур	отсутствует	высокая
Наличие антиоксидантных систем	-	+
Спектр выполняемых функций	узкий, фактически только фагоцитоз	широкий, участвуют как в реакциях неспецифического иммунитета, активируют и регулируют иммунный ответ

Характеристика фагоцитарного процесса, осуществляемого макрофагами и нейтрофилами

Признак	Нейтрофилы	Моноциты/макрофаги
Объекты фагоцитоза	Компоненты собственных разрушенных клеток и тканей, включая апоптические тела, внеклеточно размножающиеся бактерии и грибы, относящиеся к условно патогенным микроорганизмам	Те же, что и для нейтрофилов. Внутриклеточные паразиты. Облигатно патогенные микроорганизмы. В последних случаях преобладает не протективная роль фагоцитоза, а промикробная - фагоцитоз способствует диссеминации микробов по организму
Биологическая цель фагоцитоза	Только киллинг (или разрушение крупных структур для подготовки к элиминации из организма)	Киллинг и распознавание чужеродности для подготовки и активации иммунного ответа
Жизнеспособность клетки после осуществления фагоцитоза	Гибель	Сохраняется

Стадии фагоцитоза.

- хемотаксис;

- адгезия;

- активация мембраны и начало фагоцитоза;

- образование фагосомы - образуется после прикрепления фагоцита к объекту путем замыкания его мембраны вокруг патогена;

- образование фаголизосомы - образуется в результате слияния фагосомы с лизосомой фагоцитирующей клетки. После ее образования начинается процесс переваривания.

- уничтожение;

- экзоцитоз.

Хемотаксис. Чужеродные клетки (опсонизированные или неопсонизированные) посылают в окружающую среду хемотаксические сигналы, в направлении которых фагоцит начинает двигаться. В качестве хемотаксических факторов рассматривается целый ряд веществ, в том числе продукты метаболизма микроорганизмов. Пусковым фактором является комплекс антиген—антитело, определяющий высокую специфичность суммарного хемотаксического сигнала. На этот сигнал приходят первые фагоцитирующие элементы, которые, активируя другие иммунокомпетентные клетки, стимулируют их к выработке медиаторов, усиливающих хемотаксис. Далее хемотаксический потенциал усиливается за счет новообразованных антител, усиления образования комплексов антиген—антитело, а также ряда факторов, образующихся при разрушении макрофагами сосудов и тканей в воспалительном очаге. Этот хемотаксический сигнал второго порядка (развитого очага воспаления) обеспечивает поддержание в нем активной работы за счет поступления новых порций иммунокомпетентных клеток. Достигнув очага воспаления, макрофаг останавливается под влиянием фактора торможения миграции лейкоцитов, вырабатываемого Т-лимфоцитами-хелперами. Исчезновение в очаге воспаления чужеродных антигенов, начало процессов регенерации ведет к резкому уменьшению хемотаксического стимула и появлению продуктов, представляющих собой отрицательный хемотаксический сигнал. В результате этого новые фагоциты перестают мигрировать в воспалительный очаг, а оставшиеся жизнеспособные рассеиваются по всей ткани.

Адгезия. Акт адгезии включает две фазы:

• распознавание чужеродного (специфический процесс)

• прикрепление, или собственно адгезию (неспецифический процесс). Адгезия фагоцитирующей клетки к объекту фагоцитоза происходит крайне медленно в том случае, если отсутствует предварительное специфическое распознавание чужеродных клеток. У высших организмов адгезия практически всегда идет с включением специфического компонента. Для активации этого процесса необходимо небольшое количество иммуноглобулинов, которые постоянно присутствуют в организме как нормальные антитела.

Захват (собственно фагоцитоз). Важная роль в осуществлении этого этапа фагоцитоза принадлежит специфическим компонентам иммунной реакции. Известно, что захват неопсонизированных частиц идет медленно, причем часть из них вообще не фагоцитируется. Наиболее сильными опсонинами являются иммуноглобулины. Специфичность в осуществлении фагоцитоза появляется в ходе эволюции как надстройка, физиологически связанная с уже имеющейся иммунной системой. В процессе фагоцитоза плазматическая мембрана макрофага при помощи образованных ею выступающих складок захватывает объект фагоцитоза и обволакивает его. Образующаяся при этом небольшая вакуоль называется фагосомой. В дальнейшем фагосома отрывается от поверхности мембраны и перемещается в цитоплазму.

Киллинг (убийство). Уничтожение микроорганизмов — важная функция фагоцитоза, которая происходит либо при фагоцитозе (внутриклеточное уничтожение). Вещества из лизосомальных гранул могут разрушать чужеродные вещества двумя механизмами:

• кислороднезависимый механизм — осуществляется  гидролитическими ферментами;

• кислородзависимый механизм — осуществляется при участии миелопероксидазы, перекиси водорода, супероксидного аниона, активного кислорода и гидроксильных радикалов.