13. Методы исследования фагоцитарного процесса.

1. Исследование адгезивной способности фагоцитирующих клеток - определяется 1) путем микроскопического подсчета адгезировавшихся к пластику клеток, 2) по наличию на мембране адгезивных молекул с помощью МКА (проточная цитометрия).

2. Исследование хемотаксической активности фагоцитов - определяется в камере Бойдена путем подсчета числа клеток, прошедших через поры мембранного фильтра.

3. Исследование поглотительной способности фагоцитов - определяется путем микроскопического определения числа фагоцитирующих различные объекты клеток. Определяются 2 показателя: фагоцитарный показатель (или индекс) и фагоцитарное число.

4. Исследование наличия и активности ферментов (миелопероксидазы, каталазы и др.) - цитохимический метод с оптической денситометрией.

5. Исследование содержания лизоцима - определение лизоцима в лизате суспензии нейтрофилов по лизису микрококка.

6. Исследование дефензинов – ИФА

7. Исследование бактерицидного эффекта - посев бактериальной культуры до внесения в суспензию фагоцитов и после инкубации с фагоцитами (15 -30 - 60 -120 мин).

8. Исследование метаболической активности - NST-тест.

14. Механизмы контактного и дистантного киллинга, характерные для видового иммунитета.

Иммунная система располагает независимым от системы комплемента способом уничтожения чужеродных клеток. Эта форма иммунного реагирования осуществляется непосредственно клетками-киллерами и получила название «опосредованный клетками киллинг». Киллинг способны осуществлять активированные фагоциты, Т-киллеры, естественные киллеры и некоторые другие клетки. Клетки-киллеры осуществляют санацию организма от чужеродных, трансформированных или инфицированных клеток.

Механизм клеточно-опосредованного киллинга достаточно универсален. Киллеры вырабатывают ряд веществ, которые вызывают нарушение целостности клеточной мембраны (или стенки) или индуцируют апоптоз. Они осуществляют свою функцию дистантно (на расстоянии) или при непосредственном контакте. Мишенью для них являются раково-трансформированные, мутантные или зараженные вирусами клетки, грибы, простейшие, гельминты, некоторые бактерии и другие чужеродные клетки.

Способ распознавания киллерами генетической чужеродности клеток-мишеней определяется типом его антигенсвязывающего рецептора. Различают антителозависимую и антителонезависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность.

Существуетет три основных механизма клеточных реакций видового иммунитетата:

• фагоцитоз,

• дистантный киллинг,

• контактный киллинг.

Киллинговые реакции означают возможность деструкции чужеродного агента в том случае, когда объект находится рядом с клеткой эффектором. Деструкция осуществляется внеклеточно. В случае дистантного киллинга клеточный эффектор и мишень не находится в прямом контакте. В случае контактного киллинга этот контакт необходим и не осуществляется взаимодействие особых рецепторов клетки эффектора и клетки-мишени. Нужно учитывать, что достаточно часто киллинг и фагоцитоз могут взаимодополнять друг друга.

Дистантный киллинг: биологическая целесообразность его заключается в осуществлении противопаразитарного и противопроотозойного иммунитета. Паразиты, простейшие и гельминты имеют тканевые формы развития, когда они располагаются в подслизистом слое, подкожно-жировой клетчатке, рыхлой соединительной ткани, окружающих капиллярах. Эти ткани в своем составе имеют эозинофилов из циркуляторного кровеносного русла и тучные клетки, живущие в тканях в течении многих лет.

Эозинофилы и тучные клетки на цитоплазматической мембране имеют разнообразные рецепторы, улавливающие сигналы присутствия паразита в тканях. Чаще всего это сигнал метаболитов паразита, изменение уровня РН и других физико-химических констант.

Клетки-эффекторы (тучная или базофил) под воздействием этих антивирусных сигналов осуществляет дегрануляцию. Получение сигнала приводит к активации цитоскелета. Его сократительные белки активируются и этот процесс сопровождается своеобразной активацией цитоплазмотической мембраны, в силу чего внутриклеточные гранулы. соединенные биологически активными веществами оказываются в микроокружении. Вещества этих гранул (основной белок у эозинофилов - гистамин) оказывают повреждающее действие на ткани паразитов, однако дистантный киллинг относятся реакции с низкой векторностью. Повреждающему действию подвергаются паразит и рядом расположенные клетки. В месте дистантного киллинга развиваетсяся воспалительная реакция. Ее целесообразность заключается в привлечении к очагу, локализации паразита других лейкоцитарных клеток и защитных белков из кровеносного русла.

Контактный киллинг осуществляется в отношении опухольтрансформированных и вируспораженных клеток макроорганизма. Эти клетки характеризуются поверхностным расположением на цитоплазматической мембране.

Клетками эффекторами являются лимфоциты NK. NK циркулируют по кровеносному руслу, переходя в ткани при необходимости через капиллярную сеть. Большое количество натуральных киллеров присутствует в печени и некоторых других тканях. Эти клетки распознают маннозосвязанный лектин на поверхности собственных клеток благодаря соответствующим рецепторам. Благодаря взаимодействию рецепторов формируется прямой контакт.

NK получают сигнал и секретируются в пространство между клетками молекул. Вещества полимеризуются и встраиваются в цитоплазматическую мембрану клетки-мишени, формируя в ней пору. После этого секретируют в межклеточное пространство. Молекулы гранзимов (белки), которые изменяют активность митохондриальных кахепаз, инициируя апоптоз клетки-мишени. Контактный киллинг является завершенным, т.к. апоптоз способствует деградации генетического материала. НК-эффекторные клетки, способные без предварительной сенсибилизации лизировать широкий спектр клеток-мишеней. Они вариабельны по размерам, содержат азурофильные гранулы, которыми связана их цитотоксичность, митохондрии, комплекс Гольджи, крупное ядро. Они являются первой линией защиты против злокачественных опухолей, проявляют антимикробную активность в противовирусном иммунитете, способны продуцировать интерферон, участвуют в трансплоантационном иммунитете.

15. Понятие о главном комплексе гистосовместимости: номенклатура. Генетическая карта МНС, Гены I, II, III классов МНС. Молекулы I и II классов МНС: строение, распределение на клетках, физиологическое значение.

Главный комплекс гистосовместимости – это группа генов и кодируемых ими антигенов клеточной поверхности, которые играют важнейшую роль в распознавании чужеродного и развитии иммунного ответа.

Изучение разнообразия иммунологических специфических реакций на антиген, особенно активно проводимое в области трансплантации органов и тканей, привело к выводу о наличии системы генов, контролирующих силу и характер ответной реакции организма.

Каждый вид животного и человека имеет свой главный барьер, отвечающий за реакции совместимости. Весь процесс узнавания «своего» и «чужого» развивается под контролем системы генов, называемой у человека HLA-системой (Human leucocyte antigen), поскольку выяснилось, что основную функциональную роль во взаимоотношениях трансплантанта с окружением выполняет лейкоцит.

HLA-система относится к главному комплексу гистосовместимости (ГКГС). У человека гены HLA расположены в 6-й хромосоме. HLA-комплекс обеспечивает генетический контроль иммунного ответа и взаимодействие клеточных элементов, обеспечивающих иммунный ответ.

HLA включает регионы (локусы) А, В, С, D: HLA-А, HLA-В, HLA-С, HLA-D.

В HLA различают два класса: МНС I и МНС II (Maior histocompatibility complex). К классу МНС I у человека относятся локусы А, В, С; к классу МНС II – локусы: DR, DP, DQ.

Класс I антигенов МНС – это серологически выявляемые антигены, класс II антигенов МНС выявляется в клеточных реакциях (смешанная культура лейкоцитов).

Продукты генов МНС I и МНС II – это мембранные белки, основной функцией которых служит распознавание и связывание с определенными фрагментами (пептидами) антигена, несущими специфическую информацию

Антигены МНС отсутствуют на зрелых безъядерных эритроцитах.

Сейчас известен ген МНС III – часть комплекса МНС между I и II локусами, кодирующий белки системы комплимента, фактора В, цитокина ФНОα, лимфотоксина, ряда ферментов, участвующих в синтезе стероидных гормонов.

Класс МНС	Клетки, несущие МНС белки	Зоны связывания МНС на клетке	Распозн-ий Т-лимфоцит	Определение защиты от инфекции
МНС I	Все ядросодержащие клетки максимально на лейкоцитах и лимфоцитах	Цитозоль сообщающаяся с ядром, эндоплазматический ретикулум.	CD8	Вирусные, внутриклеточные бактериальные
МНС II	Дендритные клетки, В-лимфоциты, моноциты\макрофаг, эндотелий сосудов.	Внешний внеклеточный аппарат, эндоплазматический ретикулум, лизосома, фагосома.	CD4; CD4 Тх1 синтезирующие ИЛ-2	Внеклеточные

Кроме системы МНС, у человека существует семейство генов, кодирующих мембранные белки, по структуре похожие на белки МНС I. Это молекулы CD1, характеризующиеся антигенсвязывающей областью с рядом антигенов микроорганизмов (микобактерии и др.) Разные варианты CD1 экспрессированы на разных участках эпителиальных клетках (дендритные, кортикальные лимфоциты, В-лимфоциты, эпителиальные клетки и др.).

Таким образом, в организме человека имеются естественные генетические детерминированные маркеры иммунного статуса, по которым можно тестировать и прогнозировать реактивность организма.

Подытоживая изложенную информацию, можно заключить:

1. Антигены гистосовместимости являются составными частями клеточных мембран.

2. МНС I присутствует на внутриклеточных мембранах, МНС II – на внешних структурах мембраны.

3. Химическая структура молекул гистосовместимости – гликопротеиды

4. Основные источники молекул МНС – лейкоциты и лимфоциты. Основная и стабильная функция этих клеток – способность синтезировать антигены МНС-комплекса.

5. Основное значение системы МНС – контроль иммунного ответа, его силы и характера. Биологическая целесообразность формирования системы МНС – контроль постоянства антигенного гомеостаза, удаление преимущественного измененных «своих» клеток, а затем в процессе эволюции – приобретение способности участвовать в уничтожении генетически чужеродных веществ.