5.9. Исследование объектов в сложных средах

Исследования объектов в присутствии различных примесей представляют большой практический интерес, связанный с решением аналитических задач.

Наибольший интерес, с нашей точки зрения, может вызвать исследование методических возможностей при анализе биообъектов, когда их полосы поглощения перекрываются с полосами поглощения среды, где находятся анализируемые объекты. Отметим еще раз, что решение подобной проблемы может, вероятно, проходить через решение значительного количества частных вопросов. Перспективу именно такой позиции попытаемся продемонстрировать на конкретных экспериментальных примерах последующих двух глав.

На основании исследований, результаты которых представлены в данной главе, разработаны и предложены конкретные методики количественных измерений, проведенных с объектами, находящимися в различных средах.

5.9.1. Особенности получения информации из образцов

Нативные клетки, как правило, представляют собой сильно рассеивающие объекты, для анализа которых традиционные методы абсорбционного спектрального анализа, разработанные для исследования однородных веществ, оказываются малопригодными. Методы спектроскопии внутреннего отражения дополнительно к возможностям абсорбционной спектроскопии позволяют производить исследования сильно рассеивающих объектов, изучать кинетику процессов, проводить анализ объектов по слоям на разных глубинах, отстоящих от границы раздела двух сред и т.д. Все это делает методы НПВО весьма перспективными для решения широкого круга задач.

Теория спектроскопии НПВО доказывает возможность проведения спектрального анализа различных веществ (в том числе и рассеивающих свет) на разной глубине проникновения светового потока в исследуемый объект. Однако для многокомпонентных сложных гетерогенных светорассеивающих систем возникает вопрос о возможности применения данного спектрального метода к анализу тех или иных объектов в разных их слоях. Поскольку последнее положение является принципиальным, необходимо практически проверить это.

Сформулируем предварительно условия, выполнение которых гарантирует возможность получения спектральной информации с разных глубин («слоев», «срезов») проникновения светового потока в объект: 1) появление в спектрах, полученных с разных глубин, новых полос поглощения или исчезновение ранее обнаруженных полос; 2) если различаются концентрации химических компонентов в разных структурах объекта, то на разных глубинах должно изменяться соотношение полос поглощения, характеризующих эти компоненты; 3) определение дихроичных отношений на разных глубинах.

Выполнение одного из указанных условий достаточно для доказательства того, что информация поступает из различных глубин проникновения светового потока в клетку. Наиболее убедительным доказательством служит реализация всех трех условий.

Кроме того, ошибки могут возникать за счет неточной установки угла поворота поляризатора, неточной установки измерительного элемента. Поэтому была проведена экспериментальная проверка повторяемости результатов и их статистическая обработка.

При записи спектров в поляризованном свете выбираем θ = 45º, так как для этого угла падения светового потока в случае изотропного распределения молекул d_эф2 / d_эф1 = 2 (d_эф2 и d_эф1 – эффективные толщины исследуемого образца для параллельной и перпендикулярной компонент плоскополяризованного света соответственно). Оценка эффективной толщины может быть проведена по оптической плотности, которая связана с d_эф зависимостью D = ln R = α N d_эф, где R – коэффициент отражения, измеряемый в опыте. Любое отклонение этого значения от d_эф2 / d_эф1 = 2 характеризует преимущественную ориентацию образца относительно плоскости падения светового потока. Эти рассуждения справедливы при условии, что коэффициент поглощения образца  < 0,1 и θ > θ_кр. При исследовании данных объектов указанные требования являются завышенными, поэтому можно вести даже сильных амидных полос.