- •Інструкція з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції
- •Динаміка бактеріологічного дослідження хворого
- •1 Збір патологічного матеріалу для виявлення мікобактерій туберкульозу
- •1.1 Харкотиння
- •1.2 Промивні води бронхів
- •1.3 Промивні води шлунка
- •Спеціальне обладнання
- •2.2 Бактеріоскопічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.2.1 Пряма бактеріоскопія мазка з фарбуванням за Цілем - Нільсеном
- •Реактиви
- •2.2.2 Метод збагачення
- •2.2.3 Люмінесцентна мікроскопія
- •2.2.4 Фазовоконтрастна мікроскопія
- •2.3 Бактеріологічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.3.1 Обробка патологічного матеріалу при посіві на щільне живильне середовище
- •Обробка трьохзаміщеним фосфорнокислым натрієм
- •Обробка лугом з використанням гідроокису натрія - модифікований метод Петрова (використовується за рекомендаціями вооз)
- •4,0 % Гідроокис натрію (NaОн):
- •Обробка кислотою
- •2.3.2 Живильні середовища
- •2.3.2.1 Приготування щільних живильних середовищ
- •2.3.2.2. Рідкі живильні середовища
- •Напівсинтетичне середовище Школьнікової.
- •2.4 Біологічний метод дослідження
- •3 Ідентифікація виділених культур мiкобактерiй
- •3.1 Бактеріологічний (культуральний) метод дослідження
- •Атипові мікобактерії
- •3.2 Диференціація мікобактерій
- •3.2.1 Культуральні тести
- •3.2.1.1 Приготування середовища із саліциловокислим натрієм
- •3.2.1.2 Приготування середововища з паранітробензойною кислотою
- •3.2.1.3 Приготування середовища з тіоацетазоном (тібоном)
- •3.2.1.4 Ріст на середовищі з 5 % NаСl
- •3.2.1.5 Виявлення корд-фактора
- •3.2.2 Бiохiмiчнi методи дослідження
- •3.2.2.1 Ніациновий тест
- •3.2.2.2 Визначення амiдазної активності
- •Метод Бьоніке
- •Визначення нікотинамiдазної активності
- •Метод Таке
- •Визначення формамiдазної активності
- •3.2.2.3 Визначення нiтратредуктазної активності
- •3.2.2.4 Диференціація мiкобактерiй за окисно-відновними ферментами
- •Визначення каталазної і пероксидазної активності одночасно
- •Термостабiльнiсть каталази
- •Визначення активності термостабільної каталази
- •3.2.2.5 Реакція гiдролiзу твiну-80
- •3.2.2.6 Ключові тести і схеми ідентифікації мікобактерій
- •3.3 Біологічний метод ідентифікації кислотостійких мiкобактерiй
- •4 Прискоренні методи виявлення мікобактерій
- •4.1 Виявлення мікобактерій за допомогою індикаторної пробірки bbl mgit
- •4.2 Визначення медикаментозної стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів (стрептоміцин, ізоніазид, рифампіцин, етамбутол) за допомогою системи bbl mgit ast sire
- •4.3 Виявлення мікобактерій за допомогою середовища вкг (стимулятор росту і середовище вкг) (в.В.Власенко)
- •4.3.1 Постановка досліду по контролю якості живильного середовища вкг
- •1 Етап – відбір і попередня обробка досліджуваного матеріалу для характеристики днк
- •Відбір та підготовка клінічного матеріалу для аналізу.
- •Форма випуску та пакування.
- •Комплектність набору для ампліфікації днк m.Tuberculosis,м.Bovis наведена в табл.4.4.
- •3 Этап – детекція продуктів ампліфікації за допомогою гельелектрофорезу
- •Порядок проведення робіт.
- •Форма випуску й пакування.
- •5 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1 Критерії стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1.1 Визначення чутливості мiкобактерiй туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів методом абсолютних концентрацій на щільних середовищах
- •5.1.1.1 Розведення антимікобактеріальних препаратів
- •Iзонiазид
- •5.1.2 Визначення стійкості мбт до антимікобактеріальних препаратів
- •I Приготування розведень антимікобактеріальних препаратів
- •II Приготування суспензії культури мбт
- •5.3 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до декількох антимікобактеріальних препаратів
- •5.4 Визначення чутливості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів з використанням кров’яного живильного середовища
- •5.5 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих
- •5.5.1 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих методом серійних розведень в рідкому середовищі
- •5.5.1.1 Схеми розведення антимікобактеріальних препаратів для визначення мік
- •Iзонiазид
- •Рифампіцин (рифадин, мікобутин)
- •Етамбутол
- •Канаміцин
- •Фторхінолони (ципробай або інший ципрофлоксацин чи офлоксацин)
- •5.5.1.2 Визначення бактеріостатичної активності крові (бак) після прийому хворим антимікобактеріальних препаратів (туберкулостатична проба)
2.3.2 Живильні середовища
Для посіву патологічного матеріалу використовують наступні яєчні середовища: Льовенштайна-Єнсена, Фінна-2 та ін.
Середовище Льовенштайна-Єнсена рекомендоване ВООЗ для всіх координаційних лабораторій. Цим середовищем користується більшість лабораторій України.
3аслуговує уваги середовище Фінна-2. Воно відрізняється від середовища Льовенштайна-Єнсена тим, що не містить дорого L-аспарагіну. На цьому середовищі ріст мікобактерій, як правило, з’являється на декілька днів раніше, ніж на середовищі Льовенштайна-Єнсена. Використання двох середовищ одночасно підвищує відсоток виділення M.tuberculosis з патологічного матеріалу і є обов’язковим. Однак треба пам’ятати, що середовище Фінна-2 можна використовувати лише для первинного виділення мікобактерій з патологічного матеріалу.
2.3.2.1 Приготування щільних живильних середовищ
Середовище Льовенштайна-Єнсена (без крохмалю).
Сольовий розчин: однозаміщений фосфорнокислий калій - 2,4 г, магній сірчанокислий - 0,24 г, магній лимоннокислий - 0,6 г, L-аспарагін - 3,6 г, гліцерин - 12,0 мл, вода дистильована - 600,0 мл.
Реактиви розчиняють у воді у вказаній вище послідовності при слабкому нагріванні, розливають у флакони і стерилізують при 121 0С протягом 30 хвилин.
Сольова основа може бути приготовлена заздалегідь і зберігатися до 1 місяця.
Яєчна маса: 10 - 12 (в залежності від величини) свіжих дієтичних яєць миють проточною теплою водою щіткою з милом, занурюють на 30 хвилин у 70 % спирт, або оброблюють 1 – 2 хвилини 5,0 % йодною настоянкою, а потім над полум’ям пальника розбивають стерильним пінцетом у колбу з битим склом, добре струшують після кожного яйця, до отриманої однорідної яєчної маси додають 10,0 мл стерильного 2,0 % розчину малахітової зелені і 300,0 мл сольового розчину. Суміш фільтрують через марлевий фільтр і розливають у пробірки приблизно по 5,0 мл. Згортають в скошеному вигляді при 85 °С протягом 30 хвилин в апараті для згортання сироватки крові.
В даний час для виділення та культивування МБТ використовують сухі комерційні середовища для приготування сольової основи середовища Льовенштайна-Єнсена (фірма MERCK (Німеччина), а також виробництва Державного експериментального заводу медичних препаратів (м. Київ, Україна).
Середовище Фінна-2.
Сольовий розчин: магній сірчанокислий - 0,5 г, натрій лимоннокислий – 1,0 г, квасці залізоаміачні - 0,05 г, калій фосфорнокислий однозаміщений – 20,0 г, амоній лимоннокислий однозаміщений – 5,0 г, натрій глутаміновокислий однозаміщений – 10,0 г, гліцерин – 20,0 мл, вода дистильована - до 1,0 л.
Інгредієнти розчиняють у вказаному вище порядку в теплій дистильованій воді.
рН (не корегувати) - 6,3-6,5.
Розливають у флакони і стерилізують при 121 0С - 20 хвилин.
Далі чинять так само, як і при приготуванні середовища Льовенштайна-Єнсена.
Для приготування яєчних живильних середовищ використовують свіжі курячі яйця (не більше тижня), з цілою, незабрудненою шкарлупою.
Готове яєчне середовище з малахітовим зеленим повинно бути світло-зеленого кольору, без дрібних поглиблень та пухирців на поверхні, досить щільним. Знебарвлення готового середовища вказує на його надлишкову температурну обробку.
Після згортування (коагуляції) необхідно залишити всі пробірки (або вибіркові екземпляри) при 35-37 0С на 24 години для перевірки стерильності.