- •Інструкція з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції
- •Динаміка бактеріологічного дослідження хворого
- •1 Збір патологічного матеріалу для виявлення мікобактерій туберкульозу
- •1.1 Харкотиння
- •1.2 Промивні води бронхів
- •1.3 Промивні води шлунка
- •Спеціальне обладнання
- •2.2 Бактеріоскопічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.2.1 Пряма бактеріоскопія мазка з фарбуванням за Цілем - Нільсеном
- •Реактиви
- •2.2.2 Метод збагачення
- •2.2.3 Люмінесцентна мікроскопія
- •2.2.4 Фазовоконтрастна мікроскопія
- •2.3 Бактеріологічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.3.1 Обробка патологічного матеріалу при посіві на щільне живильне середовище
- •Обробка трьохзаміщеним фосфорнокислым натрієм
- •Обробка лугом з використанням гідроокису натрія - модифікований метод Петрова (використовується за рекомендаціями вооз)
- •4,0 % Гідроокис натрію (NaОн):
- •Обробка кислотою
- •2.3.2 Живильні середовища
- •2.3.2.1 Приготування щільних живильних середовищ
- •2.3.2.2. Рідкі живильні середовища
- •Напівсинтетичне середовище Школьнікової.
- •2.4 Біологічний метод дослідження
- •3 Ідентифікація виділених культур мiкобактерiй
- •3.1 Бактеріологічний (культуральний) метод дослідження
- •Атипові мікобактерії
- •3.2 Диференціація мікобактерій
- •3.2.1 Культуральні тести
- •3.2.1.1 Приготування середовища із саліциловокислим натрієм
- •3.2.1.2 Приготування середововища з паранітробензойною кислотою
- •3.2.1.3 Приготування середовища з тіоацетазоном (тібоном)
- •3.2.1.4 Ріст на середовищі з 5 % NаСl
- •3.2.1.5 Виявлення корд-фактора
- •3.2.2 Бiохiмiчнi методи дослідження
- •3.2.2.1 Ніациновий тест
- •3.2.2.2 Визначення амiдазної активності
- •Метод Бьоніке
- •Визначення нікотинамiдазної активності
- •Метод Таке
- •Визначення формамiдазної активності
- •3.2.2.3 Визначення нiтратредуктазної активності
- •3.2.2.4 Диференціація мiкобактерiй за окисно-відновними ферментами
- •Визначення каталазної і пероксидазної активності одночасно
- •Термостабiльнiсть каталази
- •Визначення активності термостабільної каталази
- •3.2.2.5 Реакція гiдролiзу твiну-80
- •3.2.2.6 Ключові тести і схеми ідентифікації мікобактерій
- •3.3 Біологічний метод ідентифікації кислотостійких мiкобактерiй
- •4 Прискоренні методи виявлення мікобактерій
- •4.1 Виявлення мікобактерій за допомогою індикаторної пробірки bbl mgit
- •4.2 Визначення медикаментозної стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів (стрептоміцин, ізоніазид, рифампіцин, етамбутол) за допомогою системи bbl mgit ast sire
- •4.3 Виявлення мікобактерій за допомогою середовища вкг (стимулятор росту і середовище вкг) (в.В.Власенко)
- •4.3.1 Постановка досліду по контролю якості живильного середовища вкг
- •1 Етап – відбір і попередня обробка досліджуваного матеріалу для характеристики днк
- •Відбір та підготовка клінічного матеріалу для аналізу.
- •Форма випуску та пакування.
- •Комплектність набору для ампліфікації днк m.Tuberculosis,м.Bovis наведена в табл.4.4.
- •3 Этап – детекція продуктів ампліфікації за допомогою гельелектрофорезу
- •Порядок проведення робіт.
- •Форма випуску й пакування.
- •5 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1 Критерії стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1.1 Визначення чутливості мiкобактерiй туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів методом абсолютних концентрацій на щільних середовищах
- •5.1.1.1 Розведення антимікобактеріальних препаратів
- •Iзонiазид
- •5.1.2 Визначення стійкості мбт до антимікобактеріальних препаратів
- •I Приготування розведень антимікобактеріальних препаратів
- •II Приготування суспензії культури мбт
- •5.3 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до декількох антимікобактеріальних препаратів
- •5.4 Визначення чутливості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів з використанням кров’яного живильного середовища
- •5.5 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих
- •5.5.1 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих методом серійних розведень в рідкому середовищі
- •5.5.1.1 Схеми розведення антимікобактеріальних препаратів для визначення мік
- •Iзонiазид
- •Рифампіцин (рифадин, мікобутин)
- •Етамбутол
- •Канаміцин
- •Фторхінолони (ципробай або інший ципрофлоксацин чи офлоксацин)
- •5.5.1.2 Визначення бактеріостатичної активності крові (бак) після прийому хворим антимікобактеріальних препаратів (туберкулостатична проба)
5.1.1 Визначення чутливості мiкобактерiй туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів методом абсолютних концентрацій на щільних середовищах
Принцип методу полягає у вирощуванні мікобактерій, виділених від хворого, на щільних живильних середовищах, що містять “критичні” концентрації препаратів (критерії резистентності).
Приготування зависі (суспензії) культури.
Готують гомогенну бактеріальну суспензію в 0,9 % розчині NaCl. Для цього культуру, що виросла на твердому живильному середовищі Льовенштайна-Єнсена знімають тампоном, попередньо змоченим у стерильному 0,9 % розчині NaCl, при цьому тампон повинен стикатися з усією поверхнею середовища. Потім тампон занурюють в пробірку, що містить 2,0 мл стерильного 0,9 % розчину NaCl, змивають культуру в рідину, попередньо розтираючи по внутрішнім стінкам пробірки. Пробірку залишають на 30 хвилин при кімнатній температурі для осадження крупних часточок культури.
Суспензію культури стандартизують по бактеріальному стандарту каламутності 5 ОД. Для цього суспензію (без осаду) обережно, не торкаючись дна пробірки, відсмоктують піпеткою в іншу пробірку та розводять ії ще в 10 разів в ізотонічному розчині NaCl.
Приготування щільного живильного середовища. У флакони з яєчним середовищем Льовенштайна-Єнсена до згортання додають розведення антимікобактеріальних препаратів. Розведення препаратів готують, створюючи в середовищі їх “критичні“ концентрації, із таблеток або ампул для парентерального введення препарату, ці розведення можна зберігати в холодильнику протягом 2 – 3 тижнів.
Важливо відмітити, що для отримання точних та якісних результатів тесту медикаментозної чутливості в Україні буде здійснюватися поступовий перехід від таблетованих та рідких лікарських форм на більш якісні хімічно чисті субстанції лікарських препаратів провідних світових виробників (Sigma, Fatol-Arzneimittel та інш.).
5.1.1.1 Розведення антимікобактеріальних препаратів
Розрахунки робляться на 50,0 і 100,0 мл середовища, яке після внесення розведення відповідного препарату розливається приблизно по 5,0 мл. Таким чином отримують середовище з препаратом для визначення чутливості відповідно до 10 – 20 культур мікобактерій. Для розведень всіх препаратів користуються стерильною дистильованою водою.
Стрептоміцин
Для визначення медикаментозної чутливості до стрептоміцину використовують дигідрострептоміцинсульфат.
1-е розведення – 100,0 мг/мл: флакон, що містить 500,0 мг (0,5 г) стрептоміцину+
5,0 мл води; якщо флакон містить 1000,0 мкг/мл стрептоміцину
(1,0 г), відповідно додають 10,0 мл води.
2-е розведення – 10,0 мг/мл (10 000 мкг/мл): 1,0 мл 1-го розведення + 9,0 мл води.
3-є розведення – 2500,0 мкг/мл: 3,0 мл 2-го розведення + 9,0 мл води.
4-е розведення – 250,0 мкг/мл: 1,0 мл 3-го розведення + 9,0 мл води.
Після додавання 1,0 мл 4-го розведення до 49,0 мл середовища отримаємо в ньому 5,0 мкг/мл стрептоміцину. До 98,0 мл середовища відповідно додають 2,0 мл розведення.