5.5.1 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих методом серійних розведень в рідкому середовищі

Принцип. Приготування серійних розведень зразка крові хворих, що одержали тест-дозу антимікобактеріальних препаратів, у рідкому живильному середовищі з наступним внесенням у кожне розведення дозованої кількості тест-мікробів. Після періоду інкубації відзначають наявність або відсутність росту мікобактерій в кожному з розведень. Метод дозволяє визначити максимальне розведення крові, що затримує ріст тест-мікробів із відомою чутливістю до даного препарату. Концентрація препарату в крові обчислюється множенням показника розведення крові на мінімальну інгібуючу концентрацію (МІК) препарату по відношенню до тест-штаму в контрольному досліді.

Компоненти:

1. Синтетичне середовище Проскауера - Бека:

- L-аспарагін – 5,0 г (або глікокол – 8,0 г);

- калій фосфорнокислий однозаміщений – 5,0 г;

- калій сірчанокислий – 0,5 г;

- гліцерин – 20,0 мл;

- лимоннокисла магнезія ^ - 1,5 г;

- дистильована вода – до 1000,0 мл.

 Примітка: лимоннокисла магнезія додається до середовища після встановлення рН 7,0 – 7,1(для цього середовище підлужується 40,0 % розчином їдкого натрію).

Середовище автоклавують 20 хвилин під тиском 0,5 атм. або піддають дрібній стерилізації.

2. Сироватка нормальна коняча. Вноситься в середовище Проскауера-Бека безпосередньо перед дослідом в кількості 1:10 (10,0 %).

3. Тонка плівка тест-штаму M.tuberculosis, пересіяна на середовище за 8 – 12 днів перед дослідом (молода культура).

Підготовка до визначення. Досліди проводять у бактеріологічних пробірках, в які розливають по 3,0 мл середовище Проскауера – Бека, що містить 10,0 % нормальної конячої сироватки. На кожний дослід використовують ряд пробірок числом від 6 до 10 (в залежності від активності препарату, концентрацію якого визначають).

Якщо дослідження проводиться в період лікування хворого, то якнайменше за 1 добу відміняють всі антибактеріальні препарати. В день дослідження хворому вранці, натщесерце, дають тест-дозу препарату (як правило, разову терапевтичну дозу). Через 2 години після перорального прийому ізоніазиду, рифампіцину, етамбутолу, канаміцину, фторхінолонів, або через 3 години після прийому етіонаміду, із ліктьової вени беруть рівно 3,0 мл крові і виливають її в асептичних умовах в стерильну пробірку, що містить 1,0 мл 5,0 % стерильного розчину цитрату натрію (як антикоагулянта).

В лабораторії в пробірку з цитратною кров’ю додають рівно 2,0 мл стерильної дистильованої води, ретельно перемішують. Отримують розведення крові 1:2. Далі мірною кінцевою піпеткою ємністю 5,0 мл відсмоктують 3,0 мл і переносять у пробірку з 3,0 мл середовища, отримують розведення 1:4 і т.д. – серійні розведення крові. У останню пробірку кров не вносять – контроль. Для кращого перемішування крові з середовищем перед тим, як перенести кров в наступну пробірку, треба тричі перемішати її піпеткою.

Далі на поверхню кожної пробірки, починаючи з контрольної, бактеріологічною лопаткою поміщають невеличкий шматочок заздалегідь (за 8-12 днів) вирощеної плівки тест-штаму M.tuberculosis (найчастіше користуються лабораторним штамом Н₃₇R_v або Academia). Пробірки поміщають в термостат при 37 ⁰С на 7 – 10 днів, поки в контрольній пробірці плівка розростеться, займаючи всю поверхню живильного середовища.

Паралельно проводиться дослід по визначенню МІК препарату по відношенню до даного тест-штаму. Для цього роблять розведення препарату, щоб отримати серію випробовуваних концентрацій.