1 Етап – відбір і попередня обробка досліджуваного матеріалу для характеристики днк

методом ПЛР

Відбір та підготовка клінічного матеріалу для аналізу.

Клінічний матеріал – зразки культур, харкотиння, кров, сечу відбирають лише одноразовими інструментами та в одноразові пластикові пробірки або контейнери з кришкою, кров збирають у пробірку з консервантом (1/10 об’єму 3,0 % ЕДТА або 4,0 % цитрату натрію).

Відібрані зразки пакують у окремі пакети, щоб уникнути контамінації і доставляють у лабораторію у ізотермічному контейнері з охолоджувачем або льодом при температурі нижчій 0 ⁰С, протягом доби.

Відібрані зразки зберігають при температурі +4,0 ⁰С не більше доби, а при -20,0 ⁰С не більше 1 місяця. Допускається одноразове заморожування та розморожування матеріалу. Кров не заморожують і зберігають при температурі +4,0 ⁰С не більше 1 доби до проведення дослідження.

Попередня обробка матеріалу.

Культура мікроорганізмів. 100,0 мкл суспензії зразка культури мікроорганізмів внести в пробірку ємністю 1,5 см³ і використовувати для виділення ДНК.

Харкотиння. До 500,0 мкл харкотиння додають 500,0 мкл спутолізина і залишають при кімнатній температурі на 30 хвилин. Центрифугують при 10 000 об/хв 5 хвилин. Надосадну рідину видаляють.

Сеча. 1 см³ сечі помістити в пробірку, центрифугувати при 10 000 об/хв. протягом 5 хвилин. Надосадову рідину обережно видалити, залишаючи над осадом 100,0 мкл рідини. Якщо осаду практично не видно, тоді в цю ж пробірку додати ще 1 см³ сечі та повторити процедуру центрифугування. Розчинити осад у рідині, що залишилася в пробірці та використовувати цю завись для виділення ДНК.

Кров. Для виділення ДНК використовують 100,0 мкл суцільної консервованої крові. Як консервант (антикоагулянт) використовують 3,0 % ЕДТА або 4,0 % цитрат натрію в кількості 10,0 % до об’єму крові.

Примітка. При використанні деяких наборів можуть бути передбачені спеціальні рекомендації по підготовці матеріалу для дослідження. У цьому випадку потрібно керуватися інструкцією, що додається до даного набору.

Виділення ДНК із клінічного матеріалу може проводитись за допомогою набору реактивів № 1 із набору MYC– ТЕSТ.

Порядок проведення робіт.

1. До осаду підготовленого матеріалу додати 400,0 мкл “Буфера ЛБ” і прогріти в термостаті при температурі 100 ⁰С на протязі 15 хвилин (кришки пробірок повинні бути щільно закритими) та охолодити при кімнатній температурі.

2. Додати в пробірки по 10,0 мкл старанно перемішаного до однорідної зависі магнітного сорбенту та перемішати.

3. Витримати 10 хвилин при кімнатній температурі, періодично (2-3 рази), струшуючи пробірку.

4. Помістити сорбент у магнітний штатив для осадження сорбенту на стінці пробірки. При відсутності магнітного штатива – осадити сорбент центрифугуванням 15 – 20 секунд при 1500 – 2000 об/хв. Надосадну рідину видалити піпеткою зі змінним наконечником.

5. До осаду в пробірці додати 300,0 мкл “Буфера ПБ 1”, струсити на центрифузі-вортексі протягом 5 – 10 секунд до гомогенного стану зависі та помістити пробірку в магнітний штатив для осадження магнітного сорбенту. Надосадну рідину видалити піпеткою зі змінним наконечником.

6. До осаду в пробірці додати 500,0 мкл “Буфера ПБ 2”, струсити на вортексі протягом 5 – 10 секунд до гомогенного стану та помістити пробірку в магнітний штатив для осадження магнітного сорбенту. Надосадну рідину видалити піпеткою зі змінним наконечником.

7. Повторити операцію 6. Звернути увагу на повне видалення надосадної рідини та уникати відсмоктування часток магнітного сорбенту.

8. Помістити пробірки в термостат при температурі 65 ⁰С на 10 хвилин, залишаючи пробірки відкритими для випаровування залишкової кількості промивної рідини.

9. Додати до осаду 30,0 мкл “Буфера ТЕ”, пробірки закрити, струсити на вортексі протягом 10 секунд та інкубувати в термостаті при темпратурі 65 ⁰С протягом 5 хвилин.

10. Пробірки струсити на вортексі протягом 10 секунд і помістити в магнітний штатив для осадження сорбенту. Відібрати для аналізу надосадну рідину, що містить виділену ДНК. Зберігати виділену ДНК при температурі -20 ⁰С або -70 ⁰С.

Умови проведення робіт.

Не допускається повторного використання пробірок і наконечників. При проведенні робіт слід використовувати одноразові рукавички, маски й халати.