2.2.3 Люмінесцентна мікроскопія

Люмінесцентна мікроскопія має більш високу чутливість у виявленні мікобактерій. Метод може бути використаний при різних видах обробки біологічного матеріалу. Цей метод значно збільшує діагностичну ефективність мікроскопічних досліджень. Швидкість виявлення мікобактерій, простота флюорохромування робить його широко доступним для практичних лабораторій. Перевагою методу люмінесцентної мікроскопії є те , що він дозволяє проводити дослідження при менших збільшеннях мікроскопа і, отже, переглядати в короткий термін значно більше полей зору, ніж при звичайній мікроскопії з імерсійною системою. Застосовуючи малі збільшення, вдається швидше виявити мікобактерії туберкульозу. Люмінесцентна мікроскопія дозволяє збільшити знахідки у порівнянні з прямою бактеріоскопією мазка. Цей метод крім того найбільш економічний з усіх бактеріоскопічних методів дослідження і рекомендується як основний метод в обласних протитуберкульозних диспансерах для проведення скринінгових досліджень із розрахунку 1 люмінесцентний мікроскоп на 500 тис. - 1 млн. населення.

Даний метод мікроскопії грунтується на здатності мікобактерій сприймати люмінесцентні барвники і потім світитися при опроміненні ультрафіолетовими променями. При цьому в залежності від застосовуваних барвників мікобактерії дають яскраво-червоне світіння на зеленому, чи золотаво-жовте на темно-зеленому тлі поля зору.

Існує ряд методик забарвлення препаратів для люмінесцентної мікроскопії: акридиновим жовтогарячим; аураміном і родаміном за Боєм; аураміном за Хагеманом; аураміном за Хагеманом в модифікації Набонна.

Для забарвлення препаратів акридиновим жовтогарячим необхідні наступні реактиви: акрединовий жовтогарячий, 3,0 % солянокислий спирт, метиловий спирт, 10,0 % розчин аміаку. З акрединового жовтогарячого готується основний розчин шляхом розчинення 1,0 г барвника в 100,0 мл дистильованої води. З основного розчину готується робочий розчин шляхом додавання 10,0 мл основного розчину до 990,0 мл дистильованої води. Сюди ж додається 3 - 6 крапель 10,0 % розчину аміаку, рН має бути не менше 9,0. Мазки готують з осаду, отриманого при обробці матеріалу для посіву, краплю якого наносять на скельце звичайним способом. Препарати фіксуються метиловим спиртом протягом 3 - 5 хвилин. Скельця для препаратів повинні бути новими, тонкими і без подряпин. Забарвлення препаратів здійснюють шляхом занурення фіксованих мазків у робочий розчин акридинового жовтогарячого на 24 години без підігріву. Потім мазки двічі по 10 хвилин знебарвлюють 3,0 % солянокислим спиртом, промивають дистильованою водою, висушують у термостаті і мікроскопують.

Для забарвлення препаратів аураміном і родаміном за Боєм необхідні наступні реактиви: аурамін 00, родамін С, 3,0 % солянокислий спирт, 0,25 % водний розчин метиленової синьки. Родамін С можна заміняти подвійною кількістю родаміу 6 Ж. Робочий розчин аураміну і родаміну готується шляхом додавання 1,0 г аураміну і 0,1 г родаміну до 1000,0 мл дистильованої води. Фіксований над полум’ям пальника мазок забарвлюють протягом 10 хвилин робочим розчином при легкому підігріванні, потім мазок промивають водою, знебарвлюють 3,0 % солянокислим спиртом і знову промивають водою. Гасіння тла роблять шляхом забарвлення препарату 0,25 % розчином метиленового синього, після чого препарат промивають водою, висушують на повітрі і мікроскопують.

Методика забарвлення препарату за Хагеманом в модифікації Набонна (аураміновий метод): на фіксований мазок наливають розчин аураміну 00 на 15 хвилин (не нагрівають мазки й не використовують стрічки фільтровального папірця), потім препарат ретельно промивають водою, знебарвлюють солянокислим спиртом 3 - 5 хвилин, промивають водою, дофарбовують розчином кислого фуксину протягом 2 хвилин, ретельно промивають водою, висушують і мікроскопують. Забарвлені препарати мають малиново-червоний колір. При люмінесцентній мікроскопії клітини мікобактерій світяться золотаво-зеленим кольором на темному чи бурувато-червоному тлі.

Методика забарвлення препаратів за Боєм в модифікації Полякової: фіксовані препарати забарвлюють розчином, що містить аурамін (1:1000) і родамін С (1:1000) протягом 20 хвилин. Потім препарат промивають водопровідною водою і знебарвлюють 3,0 % солянокислим спиртом протягом 3 - 5 хвилин. Потім цей препарат знову промивають водою і після гасіння тла 0,25 % розчином метиленової синьки протягом 1 - 2 хвилин, промивання водою і висушування, він готовий до мікроскопії. При даному методі забарвлення в препаратах при люмінесцентній мікроскопії клітини мікобактерій мають золотаво-жовтогарячий колір.

При люмінесцентній мікроскопії необхідно правильно (відповідно до інструкцій) користуватися освітлювальною апаратурою. Позитивна відповідь дається при виявленні не менше 3-х клітин мікобактерій у препараті. Кількість клітин мікобактерій оцінюється так само, як і в методиці світлової мікроскопії препаратів, пофарбованих за Цілем-Нільсеном.

Люмінесцентний метод мікроскопії підвищує результативність досліджень по виявленню клітин мікобактерій у досліджуваному матеріалі на 18,0 – 20,0 % у порівнянні зі світловою мікроскопією препаратів з нативного матеріалу і на 8,0 – 10,0 % - препаратів з матеріалу після збагачення. Слід зазначити, що люмінесцентна та пряма мікроскопія не дає можливості диференціювати M.tuberculosis від сапрофітних та умовно-патогенних мікобактерій.

Приготування барвників і реактивів для люмінесцентної мікроскопії

Розчин аураміну 00 і родаміну С (для забарвлення за Боєм):

1,0 г аураміну і 0,1 г родаміну С розчиняють у 1000,0 мл дистильованої води (для цього розчину можна застосовувати родамін 6 Ж в кількості 0,2 г на 1000,0 мл дистильованої води).

3,0 % солянокислий спирт (для забарвлення за Боєм): 3,0 мл соляної кислоти додається до 97,0 мл 70 ⁰ спирту.

Розчин аураміну 00 (для забарвлення за Хагеманом): 1,0 г аураміну 00 розчиняють у 1000,0 мл дистильованої води. У фарбу додають 5,0 мл 5,0 % розчину карболової кислоти. Водний розчин аураміну 00 не повинен давати пластівців при додаванні в нього карболової кислоти.

Кислий фуксин (для забарвлення за Хагеманом): 1,0 г кислого фуксину розчиняється в 390,0 мл дистильованої води. До цього розчину додається 10,0 мл концентрованої оцтової кислоти.

Солянокислий спирт (для знебарвлення препаратів при забарвленні за Хагеманом): до 90,0 мл спирту-ректифікату, налитого в градуйовану посудину, доливається 4,0 мл концентрованої соляної кислоти, що димить, і висипається 4,0 г хімічно чистої кухонної солі. Потім доливається дистильована вода до мітки 100,0 мл (частина нерозчиненої кухонної солі залишається в осаді).

0,25 % розчин метиленової синьки: до 100,0 мл дистильованої води додається 0,25 г метиленового синього.

Основні розчини флюорохромів можуть зберігатися в темряві багато місяців у темних флаконах, закритих скляними притертими корками чи гумовими корками, обгорн

еними алюмінієвою фольгою. Робочі розчини не повинні зберігатися більше 6 - 7 діб. Фільтрувальний папір застосовувати не можна. Якщо барвник розчинений не цілком і є осад, флакон з розчином на кілька годин можна помістити в термостат при 37 ⁰С.

Оцінка результатів люмінесцентної мікроскопії.

Мазки, пофарбовані для люмінесцентної мікроскопії, якщо неможливо переглянути відразу після приготування, слід зберігати в темному місці, переважно в холодильнику, максимум протягом доби, оскільки з часом інтенсивність світіння флюорохромів може знижуватися.

При люмінесцентній мікроскопії мазків, як правило, використовується менше збільшення (250-630), у порівнянні зі збільшенням, використовуваним при перегляді мазків, пофарбованих за методом Ціля-Нільсена (1000). Поле зору в люмінесцентному мікроскопі охоплює більшу частину мазка, ніж при світловій мікроскопії. Представлена нижче схема дозволяє порівнювати результати, отримані в різних лабораторіях, незалежно від використаного методу мікроскопії і збільшення:

Співвідношення результатів світлової та люмінесцентної мікроскопії

Світлова мікроскопія при фарбуванні за Цілем-Нільсеном		Люмінесцентна мікроскопія
Х 1000	Результат	Х 250	Х 450	Х 630
Немає / 300 полів зору	КСП не виявлені
1 - 3 / 300 полів зору	КСП не виявлені
4 - 9 / 100 полів зору	Указати точне число	Розділити	Розділити	Розділити
10 - 99 / 100 полів зору	1 +	кількість	кількість	кількість
1 - 10 в полі зору	2 +	знайдених	знайдених	знайдених
Більше 10 в полі зору	3 +	КСП на 10	КСП на 4	КСП на 2

Примітка: КСП – кислотостійкі палички.

Приклад: При перегляді мазка методом люмінесцентної мікроскопії виявлено 20 КСП у полі зору при збільшенні 450. Ділимо це число на коефіцієнт, приведений у схемі: 4, одержуємо порівнянний результат з результатом світлової мікроскопії – 5 КСП в полі зору, що може бути оцінене як 2 +, але не як 3 +.

Після перегляду препаратів методом люмінесцентної мікроскопії при необхідності можна забарвити ціж самі препарати за Цілем-Нільсеном та досліджувати їх в світловому мікроскопі.