- •Інструкція з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції
- •Динаміка бактеріологічного дослідження хворого
- •1 Збір патологічного матеріалу для виявлення мікобактерій туберкульозу
- •1.1 Харкотиння
- •1.2 Промивні води бронхів
- •1.3 Промивні води шлунка
- •Спеціальне обладнання
- •2.2 Бактеріоскопічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.2.1 Пряма бактеріоскопія мазка з фарбуванням за Цілем - Нільсеном
- •Реактиви
- •2.2.2 Метод збагачення
- •2.2.3 Люмінесцентна мікроскопія
- •2.2.4 Фазовоконтрастна мікроскопія
- •2.3 Бактеріологічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.3.1 Обробка патологічного матеріалу при посіві на щільне живильне середовище
- •Обробка трьохзаміщеним фосфорнокислым натрієм
- •Обробка лугом з використанням гідроокису натрія - модифікований метод Петрова (використовується за рекомендаціями вооз)
- •4,0 % Гідроокис натрію (NaОн):
- •Обробка кислотою
- •2.3.2 Живильні середовища
- •2.3.2.1 Приготування щільних живильних середовищ
- •2.3.2.2. Рідкі живильні середовища
- •Напівсинтетичне середовище Школьнікової.
- •2.4 Біологічний метод дослідження
- •3 Ідентифікація виділених культур мiкобактерiй
- •3.1 Бактеріологічний (культуральний) метод дослідження
- •Атипові мікобактерії
- •3.2 Диференціація мікобактерій
- •3.2.1 Культуральні тести
- •3.2.1.1 Приготування середовища із саліциловокислим натрієм
- •3.2.1.2 Приготування середововища з паранітробензойною кислотою
- •3.2.1.3 Приготування середовища з тіоацетазоном (тібоном)
- •3.2.1.4 Ріст на середовищі з 5 % NаСl
- •3.2.1.5 Виявлення корд-фактора
- •3.2.2 Бiохiмiчнi методи дослідження
- •3.2.2.1 Ніациновий тест
- •3.2.2.2 Визначення амiдазної активності
- •Метод Бьоніке
- •Визначення нікотинамiдазної активності
- •Метод Таке
- •Визначення формамiдазної активності
- •3.2.2.3 Визначення нiтратредуктазної активності
- •3.2.2.4 Диференціація мiкобактерiй за окисно-відновними ферментами
- •Визначення каталазної і пероксидазної активності одночасно
- •Термостабiльнiсть каталази
- •Визначення активності термостабільної каталази
- •3.2.2.5 Реакція гiдролiзу твiну-80
- •3.2.2.6 Ключові тести і схеми ідентифікації мікобактерій
- •3.3 Біологічний метод ідентифікації кислотостійких мiкобактерiй
- •4 Прискоренні методи виявлення мікобактерій
- •4.1 Виявлення мікобактерій за допомогою індикаторної пробірки bbl mgit
- •4.2 Визначення медикаментозної стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів (стрептоміцин, ізоніазид, рифампіцин, етамбутол) за допомогою системи bbl mgit ast sire
- •4.3 Виявлення мікобактерій за допомогою середовища вкг (стимулятор росту і середовище вкг) (в.В.Власенко)
- •4.3.1 Постановка досліду по контролю якості живильного середовища вкг
- •1 Етап – відбір і попередня обробка досліджуваного матеріалу для характеристики днк
- •Відбір та підготовка клінічного матеріалу для аналізу.
- •Форма випуску та пакування.
- •Комплектність набору для ампліфікації днк m.Tuberculosis,м.Bovis наведена в табл.4.4.
- •3 Этап – детекція продуктів ампліфікації за допомогою гельелектрофорезу
- •Порядок проведення робіт.
- •Форма випуску й пакування.
- •5 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1 Критерії стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1.1 Визначення чутливості мiкобактерiй туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів методом абсолютних концентрацій на щільних середовищах
- •5.1.1.1 Розведення антимікобактеріальних препаратів
- •Iзонiазид
- •5.1.2 Визначення стійкості мбт до антимікобактеріальних препаратів
- •I Приготування розведень антимікобактеріальних препаратів
- •II Приготування суспензії культури мбт
- •5.3 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до декількох антимікобактеріальних препаратів
- •5.4 Визначення чутливості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів з використанням кров’яного живильного середовища
- •5.5 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих
- •5.5.1 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих методом серійних розведень в рідкому середовищі
- •5.5.1.1 Схеми розведення антимікобактеріальних препаратів для визначення мік
- •Iзонiазид
- •Рифампіцин (рифадин, мікобутин)
- •Етамбутол
- •Канаміцин
- •Фторхінолони (ципробай або інший ципрофлоксацин чи офлоксацин)
- •5.5.1.2 Визначення бактеріостатичної активності крові (бак) після прийому хворим антимікобактеріальних препаратів (туберкулостатична проба)
Iзонiазид
Беруть ампулу 5,0 мл 10,0 % розчину препарату. Вона містить в 1,0 мл 100,0 мг ізоніазиду.
1-е розведення – 10,0 мг/мл: 1,0 мл iз ампули + 9,0 мл води.
2-е розведення – 1,0 мг/мл (1000 мкг/мл): 1,0 мл 1-го розведення + 9,0 мл води.
3-є розведення - 250,0 мкг/мл: 3,0 мл 2-го розведення + 9,0 мл води.
4-е розведення - 50,0 мкг/мл: 2,0 мл 3-го розведення + 8,0 мл води.
Після додавання 1,0 мл 4-го розведення до 49,0 мл середовища отримаємо 1,0 мкг/мл препарату. До 98,0 мл середовища відповідно додають 2,0 мл розведення.
Етіонамiд (або протіонамід)
1-е розведення – 25,0 мг/мл: таблетку, що містить 250,0 мг етіонаміду (або
протіонаміду), обережно розтирають в порцеляновій ступці до
однорідного порошку +1,0 мл етилового спирту (для дезинфекції)+
9,0 мл води.
2-е розведення – 5,0 мг/мл: 2,0 мл із ступки + 8,0 мл води.
3-є розведення – 1,0 мг/мл (1000,0 мкг/мл): 2,0 мл 2-го розведення + 8,0 мл води.
Якщо внести 1,5 мл 3-го розведення в 48,5 мл середовища, отримаємо концентрацію препарату 30,0 мкг/мл. До 97,0 мл середовища відповідно додають 3,0 мл розведення.
Канамiцин
Беруть ампулу канаміцину, що містить 500,0 мг в 2,0 мл розчину, тобто 250,0 мг/мл.
1-е розведення – 25,0 мг/мл: 1,0 мл із ампули + 9,0 мл води.
2-е розведення – 5,0 мг/мл: 2,0 мл 1-го розведення + 8,0 мл води.
3-є розведення – 1,0 мг/мл (1000,0 мкг/мл): 2,0 мл 2-го розведення + 8,0 мл води.
Якщо внести 1,5 мл 3-го розведення в 48,5 мл середовища, отримаємо концентрацію препарату 30,0 мкг/мл. До 97,0 мл середовища відповідно додають 3,0 мл розведення.
Рифампiцин (рифадин, мікобутин)
1-е розведення – 15 мг/мл: 150,0 мг розчинного порошку рифампіцину, що
міститься в ампулі для парентерального введення, розчиняють в
10,0 мл води.
Якщо ампульного рифампіцину немає, беруть капсулу, що
містить 150,0 мг препарату, висипають в стерильну
пробірку + 1,0 мл етилового спирту (для дезинфекції) + 9,0 мл
води. Ретельно розмішують піпеткою, отриману завись щоразу
перед кожним розведенням ретельно перемішують.
2-е розведення – 1,5 мг/мл (1500 мкг/мл): 1,0 мл 1-го розведення + 9,0 мл води.
3-є розведення – 1000,0 мкг/мл: 2,0 мл 2-го розведення + 1,0 мл води
(краще брати вдвічі більший об’єм – 4,0 мл + 2,0 мл води).
Внести 1,0 мл 3-го розведення в 49,0 мл середовища, отримаємо 20,0 мкг/мл (або 2,0 мл в 98,0 мл середовища).
Етамбутол
1-е розведення – 20,0 мг/мл: таблетку, що містить 400,0 мг препарату, ретельно
розтирають в ступці + 1,0 мл етилового спирту + 19,0 мл води.
2-е розведення – 2,0 мг/мл (2000,0 мкг/мл): 1,0 мл із ступки +9,0 мл води.
3-є розведення – 250 мкг/мл: 1,0 мл 2-го розведення + 7,0 мл дистильованої води.
Внести 1,0 мл 3-го розведення в 49,0 мл середовища, отримаємо 10,0 мкг/мл (або 2,0 мл в 98,0 мл середовища).
Хід дослідження. Живильне середовище з різними концентраціями антимікобактеріальних препаратів розливають у пробірки приблизно по 5,0 мл і згортають у скошеному вигляді при 85 0С протягом 30 хвилин в апараті для згортування сироватки крові. Середовище з антимікобактеріальними препаратами можна зберігати в холодильнику при температурі 2 - 4 0С не більше 1-го місяця. Але краще готувати свіже середовище щотижня.
Пробірки з приготованими середовищами, що містять медикаментозні препарати, і одну контрольну пробірку із середовищем, що не містить препаратів, засівають приготованою зависсю культури, по 0,2 мл у кожну пробірку(див. вище). Пробірки поміщають у нахиленому стані в термостат при 37 0С, на другий день закривають гумовими корками замість ватно-марлевих або парафінують, щоб запобігти висиханню середовища і ставлять вертикально. Посіви переглядають щотижня. Через 2 – 3 тижні після посіву реєструють отримані результати. При бідному рості в контролі пробірки ставлять ще на тиждень у термостат, після чого дають остаточну відповідь.
Оцінка результатів. Культура вважається чутливою, якщо в пробірці із середовищем, що містить препарат, виросло менше 20 колоній при рясному рості в контролі. Тільки при наявності більше 20 колоній культура розцінюється як стійка до тієї концентрації препарату, що міститься в середовищі.
При будь-якому методі визначення чутливості мiкобактерiй до антимікобактеріальних препаратів необхідно кожну серію приготованого живильного середовища з препаратами перевірити, засіваючи завідомо чутливою культурою мiкобактерiй туберкульозу. Для контролю можна користуватися чутливим лабораторним штамом M.tuberculosis Н37Rv або будь-якою старанно перевіреною чутливою культурою M.tuberculosis. Контрольна культура засівається так само, як і та, що випробовується.
Якщо середовища з препаратами приготовані правильно, контрольна культура не повинна рости при критичних концентраціях препарату, при яких не ростуть чутливі до медикаментозних препаратів штами. Поява росту контрольного штаму в пробірці з препаратом вказує на допущення помилок при приготуванні середовища з цим препаратом або на неправильне приготування бактеріальної суспензії.