Глава 18 методы идентификации микробов рода enterococcus

111. Общая характеристика бактерий рода Enterococcus. Энтерококки, ранее относимые к стрептококкам группы D — многочисленная группа бактерий рода Enterococcus, включающая виды Е. faecalis, Е. faecium, Е. avium, Е. casseliflavus, Е. durans, Е. gallinarum, Е. raffinosus и другие. В клиническом материале от человека в основном встречаются Е. faecalis и Е. faecium. Энтерококки содержат групповой антиген, который реагирует с антисывороткой стрептококков серогруппы D по Лэнсфилд.

Энтерококки вызывают оппортунистические инфекции мочевыводящих путей, бактериемию, сепсис, подострый септический эндокардит, инфекции желчных путей, абсцессы в брюшной полости.

112. Ход исследования.

112.1. Просматривают первичные посевы на чашках с кровяным агаром. Выделенные штаммы дифференцируют с гемолитическими и зеленящими стрептококками. Энтерококки образуют мелкие кремовые или белые, круглые, с ровными краями глянцевые колонии с α-, β-гемолизом или негемолитические. Из колоний с признаками, характерными для энтерококков, бактериологической петлей берут небольшое количество материала и готовят мазки для окраски по Граму. При микроскопическом исследовании энтерококки представляют собой грамположительные полиморфные кокки, располагающиеся короткими цепочками или небольшими скоплениями, что определяет необходимость дифференцировать их с гемолитическими и зеленящими стрептококками. Колонии, характерные для энтерококков, высевают в сывороточный питательный бульон для получения чистой культуры, необходимой для дальнейшей идентификации.

Суточную бульонную культуру энтерококка пересевают на желчно-щелочной агар (далее-ЖЩА) и в молоко с 0,1% метиленового синего.

На ЖЩА растут только энтерококки, колонии их круглые, блестящие, синеватого цвета, слегка выпуклые, в ряде случаев появляются на третьи сутки инкубирования при 35-37⁰ С. В пробирках с молоком энтерококки редуцируют метиленовый синий, вследствие чего уже через 16–20 часов после посева в термостате цвет среды изменяется с голубого на кремовый.

Способность микробных культур к росту на ЖЩА и редуцированию 0,1% метиленового синего в молоке указывает на принадлежность исследуемой культуры к энтерококкам.

112.2. Видовая дифференциация энтерококков.

Внутри рода энтерококки делятся по ферментативным, редуцирующим и гемолитическим свойствам на ряд видов и подвидов.

Бульонные культуры энтерококков для установления их видовой принадлежности высевают параллельно на 3 среды: на энтерококковую дифференциально - диагностическую среду (далее-ЭДДС) для определения гемолитической, протеолитической активности и способности редуцировать2,3,5- трифенилтетразолия хлорит (далее – ТТХ); на сахарно - дрожжевой агар для испытания резистентности исследуемой культуры к теллуриту калия; в столбик с 0,2% агаром для определения подвижности энтерококков.

Через 15-18 часов предварительно учитывают гемолитическую активность энтерококков, ввиду того, что при инкубации в термостате многие штаммы энтерококков вырабатывают кислые продукты метаболизма со снижением рН питательной среды до 3,8-4,2, разрушением гемоглобина и появлением вокруг колоний зон бурого цвета.

При учете ферментативной (гемолитической и протеолитической) активности определяется 4 возможных варианта изменения ЭДДС: гемолитически активные штаммы энтерококков образуют вокруг колоний белые зоны, соответствующие цвету молочного агара; у протеолитически активных штаммов появляются четко выраженные темно - красные или бурые зоны вокруг колоний; при наличии обоих (гемолитического и протеолитического) ферментов среда вокруг колоний просветляется, приобретая вид обычного питательного агара; штаммы энтерококков, не продуцирующие этих ферментов, сред не изменяют.

В конце первых суток инкубации учитывают на этой же среде способность исследуемых культур к редукции ТТХ. Е. faecalis, восстанавливающие ТТХ, растут в виде вишнево - красных колоний с белыми ободками. Е. faecium не восстанавливает ТТХ - колонии его бесцветны или окрашены в слабо - розовый цвет.

Подвижные формы энтерококков (E.gallinarum), обладая слабой редуцирующей активностью, образуют (особенно в первичном посеве материала) карликовые колонии розовых оттенков разной интенсивности.

На сахарно - дрожжевом агаре с теллуритом калия (0,07%) растут только штаммы вида Е. faecalis, устойчивые к высоким концентрациям теллурита калия. В процессе роста они восстанавливают теллурит калия, образуя при этом черные колонии, окруженные узким бесцветным ободком.

В полужидком (0,2%) агаре, засеянном уколом, подвижные формы энтерококков вызывают диффузное помутнение всего столбика среды, тогда как неподвижные виды (Е. faecium, Е. faecalis) растут только по ходу прокола.

Таким образом, основными тестами дифференциации видов Е. faecalis, Е. faecium являются редукция ТТХ и устойчивость к теллуриту калия.

Основным диагностическим признаком подвижных энтерококков, позволяющим дифференцировать их от всех остальных видов этой группы, является подвижность.

113. Идентификацию энтерококков возможно осуществлять на коммерческих тест-системах с визуальным учетом или с использованием автоматических и полуавтоматических микробиологических анализаторов.