Глава 26 питательные среды

159. Кровяной агар (питательный агар с 5% крови). В качестве основы могут быть использованы МПА, казейново-соевый агар, Колумбийский агар, другие варианты питательной среды для роста широкого спектра микроорганизмов, включая требовательные.

Приготовление среды. К расплавленному и охлажденному до 45⁰С агару, добавляют 5% дефибринированной бараньей, лошадиной или кроличьей крови, цитратной или дефибринированной крови человека без антибактериальных препаратов. Смесь тщательно перемешивают, и разливают по 20 мл в стерильные чашки Петри.

160. Кровяной агар для постановки САМР-теста.

К 2% питательному агару, рН 7,4-7,6, добавляют 0,2% глюкозы и эритроциты барана или крупного рогатого скота. Эритроциты из цитратной крови трижды промывают изотоническим раствором хлорида натрия с целью удаления антигемолизина, который может содержаться в сыворотке, затем ресуспендируют их в том же растворе до первоначального объема крови. К агару добавляют 5% взвеси эритроцитов.

161. Шоколадный агар.

Состав: 2% мясопептонный агар (МПА), 10% крови и 5% дрожжевого экстракта от объма МПА, рН 7,4-7,6.

Приготовление. К охлажденному до 75⁰С МПА асептически добавляют половину необходимого объема крови, тщательно перемешивают и нагревают в течение 3-5 минут на водяной бане при 80⁰С, непрерывно помешивая. Остужают при комнатной температуре до 75⁰С, добавляют вторую часть крови и снова нагревают в течение 3-5 минут, непрерывно помешивая. Остужают при комнатной температуре до 45- 50⁰С и добавляют дрожжевой экстракт (5г на 1л основы). Агар тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

Недостатком шоколадного агара является невозможность наблюдать гемолитические свойства гемофильных бактерий, которые позволяют дифференцировать H.haemolyticus и H.parahaemolyticus от Н. influenzae и H.parainfluenzae. Для селективного выделения гемофильных бактерий из клинического материала нижних дыхательных путей могут быть использованы питательные среды, содержащие бацитрацин. Высокая концентрация этого антибиотика подавляет рост большинства других микроорганизмов, являющихся представителями микрофлоры дыхательных путей (стафилококков, микрококков и стрептококков), что позволяет получить рост гемофильной палочки из сильно контаминированного клинического материала.

162. Селективная среда для выделения и дифференцирования H.influenzae и H.parainfluenzae (Taylor D.C. и др.). Состоит из гемин- и НАД-обогащенного сердечно-мозгового агара, сахарозы (10 мг/мл), индикатора фенолового красного (100 мкг/мл) и бацитрацина (300 мкг/мл). На этой среде колонии H.parainfluenzae имеют желтую окраску в связи с их способностью продуцировать кислоту из сахарозы, а колонии H.influenzae - бесцветные, так как не ферментируют сахарозу. Недостаток данной среды состоит в невозможности наблюдать гемолитические свойства гемофилов.

Вместо содержащих антибиотик сред при выделении гемофильной палочки из контаминированного материала могут быть использованы коммерческие диски с бацитрацином (10ЕД) или сапонинобацитрациновые диски. Природноустойчивые к бацитрацину гемофильные палочки будут расти вокруг диска.

163. Шоколадный бульон.

Состав: основа питательный бульон pН 7,4-7,6.

Приготовление аналогично приготовлению «шоколадного» агара.

Пример: на 180 мл питательного бульона добавляют 18 мл крови (9 мл эритроцитарной крови и 9 мл сыворотки крупного рогатого скота) и 9 мл дрожжевого экстракта.

164. Сахарный бульон.

Приготовление среды. К 100 мл питательного бульона, рН 7,2-7,4, прибавляют 1г глюкозы. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут или при 0,5 атмосферы 30 минут.

165. Сывороточный бульон.

Приготовление среды. К питательному бульону, добавляют 20% мл лошадиной или бычьей сыворотки. Среду разливают в пробирки по 5 мл, выдерживают 2 суток в термостате для контроля стерильности, а затем хранят в холодильнике.

166. Сывороточный агар.

Приготовление среды. К расплавленному и охлажденному 45- 50⁰С питательному агар прибавляют 15-20% лошадиной или бычьей инактивированной при температуре 56⁰С в течение 30 минут сыворотки. После перемешивания среду разливают в чашки. Среда годна к употреблению только в течение 48 часов при хранении ее в холодильнике. Перед посевом чашки, хранившиеся в холодильнике, должны быть подогреты до температуры 37⁰ С.

167. Желточно-солевой агар.

Приготовление среды. В качестве основы используют элективный солевой агар для стафилококков. К расплавленному и охлажденному до 45⁰– 50⁰С агару, добавляют 20% желточной взвеси (асептически извлеченный из яйца желток взбалтывают с 200 мл изотонического раствора хлорида натрия). Смешивают тщательно агар с желточной взвесью, разливают по 20 мл в чашки Петри. Хранят в холодильнике в течение двух недель.

168. Среда Хью-Лейфсона.

Принцип. Среда позволяет уловить изменения рН даже при слабом окислении углеводов, что достигается заменой аминокислот питательной среды пептоном. В этой среде отсутствуют щелочные продукты расщепления аминокислот, которые могут нейтрализовать кислые продукты при утилизации углеводов. Ингредиенты:

Пептон - 2,0 г

Натрий хлористый - 5,0 г

Калий фосфорнокислый двузамещенный (К₂НРО₄ ) - 0,3г

Глюкоза - 10,0 г

Агар - 3,0 г

Бромтимоловый синий - 0,03 г

Дистиллированная вода - 1000,0 мл

Приготовление среды. К воде прибавляют пептон, натрий хлористый и агар. Смесь подогревают до расплавления агара. Затем добавляют калий фосфорнокислый двузамещенный и глюкозу. Продолжают кипятить 2-3 минуты. Смесь подщелачивают 20% раствором едкого натра до рН 7,4-7,5, доводят объем среды до первоначального и добавляют 3 мл 1% водного раствора бромтимолового синего. Среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 10-15 мл в стерильные пробирки. Стерилизуют при 0,5 атм. 20 минут. Цвет среды до стерилизации - синий, после автоклавирования - травянисто-зеленый, рН 7,1-7,2. При кислом рН среда желтеет.

169. Среда Сабуро.

Приготовление. На 1л дистиллированной воды 10,0г пептона, 18,0г агар - агара. Нагревают до расплавления агара, добавляют 40,0 г глюкозы, рН 5,8, стерилизуют при 0,5 атм. 30 минут.

170. Индикатор Андреде.

Рецепт №1. Посуда должна быть химически чистой с притертой пробкой. К 160 мл 1N едкого натрия добавить 2,5г кислого фуксина. Раствор оставить при 37⁰ С на 1-2 суток, периодически встряхивая. Долить до 1,0л и сутки выдерживать на свету при комнатной температуре. Окраска раствора – соломенно-желтого цвета или слегка розового оттенка. Хранить в темном месте.

Рецепт №2. Состав:

Фуксин кислый - 5,0

Натрий гидроокись (NaОН) 1 N раствор - 150,0 – 180,0

Дистиллированная вода - 1000,0

Приготовление. Кислый фуксин растворяют в воде и добавляют раствор щелочи, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 24 часа, периодически встряхивая. Цвет должен измениться от красного до коричневого. Если цвет не изменился, то добавляют еще 10,0 мл щелочи и выдерживают индикатор еще 1 сутки. По другой прописи смешанные ингредиенты выдерживают 24 часа в термостате при 37⁰ С и затем 48 часов при комнатной температуре на свету. Хранят готовый индикатор в бутыли темного стекла с притертой пробкой в обычных условиях.

171. Дрожжевой автолизат.

1000,0 г хлебопекарных дрожжей разводят в 1 дм ³ питьевой воды и помещают в термостат (сушильный шкаф) при температуре 55±1⁰ С на 72 часа. Полученную суспензию переносят в стерилизатор и выдерживают при температуре 115-37⁰ С 15 минут. Автолизат фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Осадок промывают таким количеством питьевой воды, чтобы общее количество фильтрата составило 4 дм³ . Фильтрат нейтрализуют раствором с массовой долей гидроокиси натрия 20% до рН (6,8±0,1), разливают в пробирки диаметром 21 мм по (32±3) см³, закрывают ватной пробкой и стерилизуют при температуре (121-37)⁰ С в течение 20 минут.

172. Питательные среды при исследовании на гемокультуру.

172.1. «Двойная среда» состоит из скошенного во флаконе 150 мл 1,7%-2% питательного агара и 150 мл полужидкой среды, приготовленной на питательном бульоне с добавлением 15 г глюкозы и 0,15 г агара. Кровь засевают в жидкую часть среды. Инкубируют в термостате при 35-37⁰ Флаконы ежедневно просматривают, при этом, наклоняя флакон, смачивают поверхность скошенного агара бульоном. Это исключает необходимость высева на плотные питательные среды и уменьшает риск загрязнения при пересевах.

172.2. «Среда для контроля стерильности». Эту среду следует обогатить, добавив 15-20 г дрожжевого экстракта и 4,25-5,0 г агара на 1 литр. В качестве индикатора анаэробиоза добавляют 0,001 г резазурина, который краснеет в присутствии кислорода. В случае покраснения более 20% верхней части столбика среду регенерируют, прогреванием в течение 20 минут в кипящей водяной бане. Регенерацию можно провести лишь однократно.

172.3. Жидкая среда Сабуро. Приготовление: на 1литр дистиллированной воды берут 10 г пептона, 25 г хлористого натрия, 40 г глюкозы. Разливают во флаконы по 150-200 мл, стерилизуют при 0,5 атмосфер 20 минут (рН 5,5). В жидкую среду Сабуро засевают 3-4 мл крови.

173. Питательные среды для дифференциальной диагностики стафилококков.

173.1. Глицериновый агар. 10,0г пептона ферментативного, 5,0г хлористого натрия, 5,0г отмытого агар-агара для микробиологических целей, 1000,0 мл дистиллированной воды, рН 7,2-7,4, кипятят до растворения ингредиентов, добавляют 20,0 мл глицерина, 10,0 мл индикатора Андреде. Разливают в стерильные пробирки по 5-6 мл. Стерилизуют при 112⁰ С 20 мин. Скашивают.

173.2. Среда для определения лецитиназы. Основой среды является 1,8% питательный агар, содержащий 7,5г NaCl на 100 мл среды. К 200 мл растопленного и охлажденного до 50⁰ С агара добавляют молочно - желточную смесь, которую готовят следующим образом: во флаконе с 20 мл стерильного снятого молока эмульгируют 2 мл яичного желтка. После добавления смеси в агар среду тщательно перемешивают и разливают по 20 мл в чашки Петри. Готовая среда содержит примерно 10% молока и 1% яичного желтка.

174. Питательные среды для дифференциальной диагностики энтерококков.

174.1. ЖЩА. Сухой питательный агар - 35,0 г; дрожжевой автолизат - 20,0 мл; глюкоза - 10,0 г; дистиллированная вода - 600 мл. Агар расплавляют, профильтровывают, добавляют свежей бычьей желчи - 400,0 мл и карбонат натрия - 5,0 г. Стерилизуют готовую среду автоклавированием при 112⁰С в течение 15 минут. Перед разливкой в чашки к среде прибавляют 50,0 мл свежей крови (барана, кролика или человека), 12,5 мл 0,01% раствора кристаллического фиолетового и 20 мл раствора КОН.

174.2. Молоко с метиленовым синим. Свежее молоко доводят до кипения, оставляют на сутки, освобождают от сливок, вторично кипятят, снова оставляют на сутки и вторично снимают верхний слой. Обезжиренное таким образом молоко фильтруют через толстый слой ваты, подщелачивают 10% раствором карбоната натрия до рН 7,2. К 100 мл молока прибавляют 2,0 мл 1% водного раствора метиленового синего. Приготовленную таким образом среду разливают по 5,0 мл в стерильные пробирки, стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 минут.

174.3. ЭДДС. Сухой питательный агар - 35г, автолизат дрожжевой для приготовления питательных сред - 20 мл, глюкоза - 10г, дистиллированная вода - 800 мл. Расплавляют при нагревании, профильтровывают, стерилизуют при 112⁰ С 15 минут, рН 7,2-7,4.

Перед разливкой в чашки в питательную среду добавляют ТТХ - 0,1 г; водного раствора кристаллического фиолетового 0,01% - 12,5 мл; налидиксовой кислоты - 0,1 г; стерильного обезжиренного молока, подогретого до 44-45⁰С - 200 мл; свежей дефибринированной крови (животных или человека) - 50 мл. Содержимое тщательно размешивают и разливают по чашкам по 7 мл.

174.4. Сахарно-дрожжевой питательный агар с теллуритом калия. Сухой питательный агар - 35г, дрожжевой автолизат - 20 мл, глюкоза - 10г, дистиллированная вода - 1000 мл. Приготовленную смесь расплавляют при нагревании, добавляют лимоннокислого натрия - 5,0 г. Стерилизуют среду при 112⁰С в течение 15 минут, рН 7,2-7,4. Перед разливкой среды в стерильные чашки добавляют 50 мл лошадиной сыворотки, 0,1 г налидиксовой кислоты и 0,7 г (35 мл 2% водного раствора) теллурита калия, тщательно размешивают.

174.5. Питательный бульон с глюкозой. К 100 мл питательного бульона, рН 7,2-7,4, прибавляют 0,2 г глюкозы. Приготовленную среду стерилизуют дробно 3 дня подряд по 20 минут или однократно 15 минут при 0,5 атм. в автоклаве.

175. Питательные среды для дифференциальной диагностики гемофилов.

175.1. Среды Гисса (определение сахаролитических ферментов). Ингредиенты: индикатор Андреде, пептон, натрий хлористый, углеводы (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, фруктоза).

Для приготовления индикатора Андреде берут кислого фуксина - 1,0г, 1 моль/л едкого натра - 64 мл, дистиллированной воды - 400 мл.

Приготовление среды. К 100 мл дистиллированной воды прибавляют 1г пептона, 0,5г натрия хлористого, 2 мл индикатора Андреде, нагревают до 80⁰С, рН 7,2. Затем среду кипятят 5 минут, фильтруют и доливают до первоначального объема дистиллированной водой. Добавляют 1г одного из углеводов. Стерилизуют 3 дня текучим паром по 30 минут или при 0,5 атм. 15 минут.

Ход исследования. В пробирки после посева культуры добавляют 2-3 капли инактивированной сыворотки лошади или крупного рогатого скота для более активного расщепления углеводов. При расщеплении углеводов среда из бесцветной становится красной.

176. Питательные среды для дифференциальной диагностики псевдомонад.

176.1. ЦПХ-агар. К питательной основе добавляют 0,2% N-цетилпиридиния хлорида - катионного поверхностно-активного вещества, подавляющего рост микроорганизмов, возможных ассоциантов псевдомонад в клиническом материале. Ингредиенты:

Пептон ферментативный - 20,0 г

Калий сернокислый - 7,0 г

Магний хлористый - 1,5 г

Магний сернокислый - 1,5 г

N-цетилпиридиний хлорид - 2,0 г

Агар-агар - 10,0 г

Вода дистиллированная - 1000,0 мл

рН среды 6,8-7,0

Приготовление. Все ингредиенты смешивают, среду доводят до кипения, кипятят 2-3 минуты до расплавления агара и разливают в чашки Петри. Активность среды сохраняется в течение 1 месяца при хранении при 4⁰ С.

176.2. Среда Кинг А.

Ингредиенты:

Пептон - 20,0 г

Глицерин - 10,0 г

Калий сернокислый - 10,0 г

Магний хлористый - 1,4 г

Вода дистиллированная - 1000 мл

Агар - агар - 20,0 г

Приготовление. Все ингредиенты смешивают, кипятят до расплавления агар - агара, разливают во флаконы и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. в течение 20 минут.

176.3. Среда с ацетамидом. Ингредиенты:

Натрий хлористый - 5,0 г

Магний сернокислый - 0,2 г

Аммоний фосфорнокислый однозамещенный - 1,0 г

Калий фосфорнокислый двузамещенный - 1,0 г

Ацетамид - 20,0 г

Агар-агар - 15,0 г

Вода дистиллированная - 1000 мл

рН среды 6,7-6,8

Приготовление. Все ингредиенты смешивают, кипятят до расплавления агар-агара, разливают во флаконы и стерилизуют в автоклаве при 1 атм. 20 минут.

176.4. Питательная желатина.

Ингредиенты:

Питательный бульон - 100 мл

Желатина - 12,0 г

Натрий двууглекислый 10% раствор

рН 7,0

Приготовление. К 100 мл питательного бульона добавляют 12г измельченной желатины. Ставят для набухания на 1 час при комнатной температуре, затем на водяную баню при температуре 40-45⁰С для растворения. С помощью 10% раствора натрия двууглекислого устанавливают рН 7,0. Стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин.

177. Питательные среды для дифференциальной диагностики листерий

177.1. Лецитин-агар с активированным углем и без угля. К питательной среде ГРМ № 1 перед стерилизацией добавляют 0,5% активированного угля, растертого до порошкообразного состояния. Желток куриного яйца разводят в 150 см³ физиологического раствора и добавляют в количестве 5% по объему к стерилизованной и охлажденной до 40-45⁰С питательной среде. Разливают в чашки Петри не более 20 см³ на чашку и подсушивают при 35-37⁰ С. Аналогично готовят среду с добавлением желтка, но без добавления активированного угля.

177.2. Среда для определения подвижности. 20г гидролизата казеина ферментативного, 6г пептона мясного ферментативного, 5г агара растворяют в 1 000 см³ дистиллированной воды, устанавливают рН 7,3+0,2, разливают в пробирки по 5-7 см³ автоклавируют при 121⁰С 15 минут.

178. Питательные среды, выпускаемые промышленностью.

Мясо-пептонный агар (МПА), Мясо-пептонный бульон (МПБ), триптиказо-соевый бульон, триптиказо-соевый агар, эритрит-агар, среда Эндо, среда МакКонки, ЕМВ-агар (агар с эозином и метиленовым голубым), агар с эозин-метиленовым синим (ЭМС-агар), висмут-сульфит агар, агар с бриллиантовым зеленым, SS-агар (сальмонелла-шигелла агар), трехсахарный агар с солями железа (TSI), среда Левина, агар Симонса, агар Кристенсена, энтерококкагар, азидный агар с эскулином и желчью, среда Клиглера, среда Олькеницкого, XLD агар (ксилозо-лизин-дезоксихолатный), ТСВS-агар (тиосульфат-цитрат-желчно-сахарозный агар), CLED – агар, селенитовый бульон, питательная среда для накопления сальмонелл – магниевая среда, основа агара Байэрд-Паркера, среда для определения чувствительности к антибиотикам (Мюллер-Хинтон агар), агар ацетатный, агар элективный солевой (агар для стафилококков), солевой агар с маннитом, среда Сабуро, среды Гисса с углеводами, основа тетратионатного бульона, эритритагар, агар Шедлера, бульон Шедлера, Колумбийский бульон, Колумбийский агар, «Среда для контроля стерильности» (СКС), тиогликолевая среда, агар с цетримидом (Цетримид агар) – сухие промышленные питательные среды, состав и способ приготовления указаны на этикетке.

179. Допускается использование других коммерческих питательных сред, систем идентификации и диагностических препаратов, предназначенных для целей описываемых методов зарегистрированных в Республике Беларусь в установленном порядке. При их применении руководствоваться рекомендациями производителя.