Глава 9 методы исследования отделяемого из нижних отделов дыхательных путей

48. Инфекции нижних отделов дыхательных путей – это инфекции, возникающие в трахее, бронхах или легочной ткани (трахеиты, бронхиты, легочные абсцессы, пневмонии). Особенностью микробиологического исследования при инфекциях дыхательных путей является почти обязательное наличие в исследуемом материале нескольких видов микроорганизмов. Основные возбудители при разных нозологических формах инфекций нижних дыхательных путей представлены в приложении 8 к настоящей Инструкции.

49. Взятие исследуемого материала.

49.1 Неинвазивные методы.

Мокроту следует отбирать утром, до приема пищи, в стерильный контейнер с крышкой, предварительно почистив зубы и тщательно прополоскав рот кипяченой водой. В случае плохого отхождения мокроты необходимо сделать ингаляцию солевым раствором, а затем откашлять отделяемое из бронхов.

Признаки правильно собранной мокроты: гнойная зеленая; гнойная желтая; слизисто-гнойная (т.е. частично гнойная, частично слизистая); с прожилками крови; с прожилками крови и зелеными включениями.

Признаки неправильно собранной мокроты (мокроты, содержащей в основном секреты ротовой полости и глотки): серая слизистая; серая пенистая; белая слизистая; белая пенистая; белая слизистая с частицами пищи; водянистая (т.е. присутствует лишь слюна); водянистая, с частицами пищи.

49.2. Инвазивные методы.

Трахеобронхиальные смывы. Гортанным шприцем в трахею вводят примерно 10 мл стерильного физиологического раствора и собирают откашливаемый смыв. У маленьких детей через катетер вводят в трахею 5-10 мл стерильного физиологического раствора и затем отсасывают транс-бронхиальный смыв. Бронхиальные смывы, в том числе вблизи очага воспаления, могут быть сделаны с помощью бронхоскопа. Недостатком является значительное разведение трахеобронхиального содержимого, что снижает возможность выделения бактерий.

Браш-биоптат получают их глубины бронхов с помощью специальной канюли с защитными щёточками, что предохраняет материал от контаминации флорой верхних дыхательных путей и позволяет производить исследования на анаэробы.

Пунктат из очага воспаления (инфильтрат, абсцесс) получают при трансторакальной пункции под рентгенологическим контролем.

Отбор материала проводится в стерильный контейнер объемом не менее 1 мл (при подозрении на грибковое поражение не менее 10 мл). Образец должен быть доставлен на исследование в течение 2-х часов. Допускается хранение материала в течение 24 часов при 4 °С (холодильник).

50. Микроскопия исследуемого материала.

Для приготовления мазка из мокроты, мокроту распределяют тонким слоем по дну чашки Петри, с помощью двух игл или пинцета выбирают слизистые либо гнойные комочки и переносят их на середину предметного стекла. Затем берут второе стекло и накладывают поверх первого. Комочки мокроты растирают между двумя стеклами до тех пор, пока не получится достаточно тонкий мазок. Во избежание инфицирования рук работающего, и на первом и на втором стеклах мазки не должны занимать более 1/2-2/3 поверхности. Высушенные мазки фиксируют в пламени спиртовки и окрашивают по Граму, а при подозрении на туберкулез - по Циль-Нильсену, при необходимости – другими методами. Результаты бактериоскопии сообщают лечащему врачу в виде предварительного ответа.

Препарат мокроты исследуют под малым увеличением микроскопа (объектив ×10) не менее 20-30 полей зрения. При наличии менее 10 полиморфноядерных лейкоцитов и более 25 эпителиальных клеток культуральное исследование нецелесообразно, так как в этом случае изучаемый материал содержит примесь содержимого ротовой полости. Критерии оценки качества материала собранного из нижних отделов дыхательного тракта представлены в приложении 9 к настоящей Инструкции. Суммарная оценка всех параметров 0 и менее свидетельствует о контаминации материала микрофлорой носоглотки. При обнаружении микроорганизмов отмечают их морфологические и тинкториальные свойства (кокки, палочки, отношение к окраске по Граму). При острой инфекции в мокроте, как правило, обнаруживают не более 1-2 типов бактерий, локализованных вблизи гранулоцитов. Микроорганизмы, попавшие из ротовой полости, чаще располагаются около эпителиальных клеток. При исследовании мокроты бактериоскопия мазков является обязательной, так как позволяет судить о качестве взятия мокроты и, во многих случаях, сделать заключение о предполагаемой этиологии инфекции нижних дыхательных путей.

51. Посев исследуемого материала.

51.1. Питательные среды: Основные среды: кровяной агар (для получения роста пневмококков после посева материала на I сектор накладывают диск с оптохином); шоколадный агар с селективной добавкой для гемофильной палочки или кровяной агар с 2-3 сапониновыми дисками (бумажные диски диаметром 6 мм пропитывают 5% водным раствором сапонина, высушивают и хранят при 4⁰С не более месяца).

Дополнительные питательные среды: ЖСА, среда Эндо (среда МакКонки), среда Сабуро, анаэробный агар (только для биологического материала собранного инвазивным способом). Для выделения легионелл, бордетелл, микоплазм необходимо использовать специальные селективно- дифференциальные среды.

51.2. Посевы на кровяном и шоколадном агаре инкубируют - при 35-37⁰ С, 5-10% СО₂, в течение 24-48 часов, на среде Эндо (среде Мак-Конки) – при 35-37⁰ С в аэробных условиях, в течение 24 часов; ЖСА - при 35-37⁰ С в аэробных условиях, в течение 24-48 часов; среде Сабуро - при 25-30⁰ С в аэробных условиях в течение 72 часов; на анаэробном агаре - при 35-37⁰ С в анаэробных условиях в течение 7 дней. Чашки с биологическим материалом просматривают ежедневно.

52. Существуют два подхода к культуральному исследованию мокроты, которые достаточно информативны, а полученные с их помощью результаты тесно коррелируют друг с другом.

52.1. Первый вариант. Мокроту выливают в чашку Петри. С помошью игл, пинцета выбирают 2-3 гнойных комочка, вносят в сосуд (пробирку, колбочку) с 5-10 мл мясопептонного бульона или 2% пептонной воды (рН 7,4-7,6). Осторожно комочки 2-3 раза отмывают. Затем их переносят на питательные среды и равномерно распределяют микробиологической петлей на 1/4 поверхности чашки Петри и производят рассев биологического материала на сектора II – IV (используя одну бактериологическую петлю). Схема посева материала представлена в приложении 2 к настоящей Инструкции.

В результате «отмывки» удаётся освободиться от некоторого количества микроорганизмов – нормальной микрофлоры верхних дыхательных путей. В среднем стократно снижается концентрация непатогенных нейссерий, зеленящих стрептококков, негемолитических стрептококков, стафилококков. Но иногда на 1-2 lg снижается и концентрация этиологически значимых микроорганизмов (пневмококков и гемофилов).

Промывные воды бронхов засевают аналогичным образом, но без предварительной отмывки.

Оценка результатов.

При появлении роста на плотных средах проводят учет колоний различной морфологии, учитывая их рост на секторах: рост колоний микроорганизмов на только I секторе - скудный рост; на I-II секторах - умеренный рост; на III- IV секторах – массивное количество.

Проводят видовую идентификацию микроорганизмов. Отрицательный результат исследования выдается при отсутствии роста на всех питательных средах в течение 3-5 суток.

52.2. Второй вариант. В основе количественного метода лежит высев на плотные питательные среды из разведений мокроты. Гомогенизация материала позволяет нивелировать неравномерность микробного обсеменения и проводиться разными способами: использование муколитиков (ацетилцистеин, мукосольван и другими), применение ферментов (трипсин, хемотрипсин, панкреатин), физическими (ультразвук), механическая гомогенизация (ступка с песком, размельчитель тканей и другие).

Наиболее эффективно применение 0,5% раствора ацетилцистеина. Ацетилцистеин не угнетает рост пневмококков, а выделение гемофильных палочек улучшается, так как он снимает ингибирующее действие муцина на H. influenzae. В неметаллический сосуд вносят равные объёмы патологического материала (0,5-1мл мокроты) и муколитика и тщательно перемешивают пипеткой с резиновой грушей 1-2 мин. Ввиду бактерицидного действия ацетилцистеина сразу же делают разведение обработанного материала в соотношении 1:5 (в 1 мл обработанного материала добавляют 4,5 мл мясопептонного бульона или 2% пептонной воды), чем достигается разведение исходного субстрата 1:10 (10¹).

Механические методы гомогенизации материала.

В ступку со стерильным кварцевым песком вносят 0,5- 2 мл материала и растирают (25-30 раз) с добавлением 2% пептонной воды или питательного бульона до концентрации 1:10.

Гомогенизация со стеклянными бусами. Берут 1 мл мокроты, добавляют 9 мл питательного бульона или 2% пептонной воды (разведение 1:10, т.е. 10¹) и гомогенизируют в банке со стеклянными бусами 20 мин.

Посев материала.

Приготовленный гомогенизат мокроты принимается за разведение материала 10^-1. Из него готовят ряд серийных разведений до 10^-7 в питательном бульоне или 2% пептонной воде. Засевают по 0,1 мл из разведений 10^-7, 10^-5 , 10^-3 , на чашки с кровяным агаром и шоколадным агаром. Посев на ЖСА, среду Эндо (среду МакКонки), среду Сабуро, анаэробный агар делают из исходного разведения 1:10.

53. Содержимое бронхов полученное при бронхоскопии или при заборе через трахеостому, засевают как мокроту, но без предварительного отмывания гнойных комочков. При отсутствии комочков гноя и слизи производят посев материала, набирая его стерильной пипеткой.

Подсчитывают каждый вид микроорганизма. Количество микроорганизмов определяют в максимальном разведении, в котором удалось обнаружить данный вид бактерий. Например: на кровяном агаре выросли 3 колонии пневмококка при посеве 0,1 мл мокроты с разведения 10^-5 , следовательно, в 1 мл мокроты содержится 3х10 и умноженное на 10⁵ (степень разведения) = 3000000 пневмококков или 3х10⁶.

54. Оценка результатов.

Диагностически значимым при исследовании мокроты является обнаружение пневмококка и гемофильной палочки (до антибактериальной терапии) в 1 мл в концентрации 10⁶ и выше. Аналогичные концентрации значимы и для условно – патогенных микроорганизмов в случае 2-3 кратного обнаружения с интервалом 3-5 дней. Следует учитывать, что на фоне адекватной антибиотикотерапии происходит снижение количества бактерий в материале.

При количественном подсчете бактерий в трахеобронхиальных смывах, представляющие собой гомогенную взвесь, условно принимают за разведение 1:9. Диагностически значимым является обнаружение пневмококков и гемофильной палочки (до антибактериальной терапии) в концентрации 10⁴. Аналогичные концентрации значимы и для условно - патогенных микроорганизмов в случае 2-3 кратного обнаружения с интервалом 3-5 дней.