1. Основные правила формирования консенсусной (результирующей) нуклеотидной последовательности

На каждый участок анализируемого фрагмента должно быть получено не менее двух электрофореграмм, в противном случае результат анализа участка считается недостоверным.

Консенсусная последовательность должна быть проверена во всех точках, где автоматическая интерпретация указала на наличие полиморфизма – более одного нуклеотида на позицию указывается специализированным буквенным кодом IUPAC, а также в кодонах, ассоциированных с мутациями устойчивости.

Буквенный код IUPAC для обозначения полиморфных позиций

K	G/T	W	A/T	H	A/T/C
M	A/C	Y	C/T	V	A/G/C
R	A/G	B	C/T/G	N	A/C/G/T
S	C/G	D	A/T/G	X

Для проверки рекомендуется придерживаться следующих правил:

• Если в двух электрофореграммах для позиции наряду с четкими пиками присутствуют одинаковые подпики, необходимо ввести в позицию вырождение. Если подпик присутствует лишь в одной электрофореграмме, ввести в консенсусную позицию нуклеотид, соответствующий основному пику.

• Если на одной из электрофореграмм в анализируемой позиции присутствует нескольких слабовыраженных пиков одновременно, а на другой электрофореграмме четкий пик, соответствующий какому-либо из нуклеотидов, то в общей последовательности вместо вырождения в анализируемой позиции следует поставить четко интерпретируемый нуклеотид.

• Если на одной из электрофореграмм в анализируемой позиции присутствует несколько четких пиков одновременно, а на другой электрофореграмме один четкий пик, соответствующий какому-либо из нуклеотидов, то в общей последовательности данную позицию следует считать вырожденной.

• Если присутствует эффект смещения (соседние пики накладываются друг на друга), то в общей нуклеотидной последовательности следует указать основание, присутствующие на второй электрофореграмме.

• Eсли присутствует эффект истощения краски (пики с малой амплитудой), то участок электрофореграммы следует исключить из анализа.

Слабовыраженный пик – пик, высота которого меньше или равна 1/3 средней высоте пиков в электрофореграмме. Четкий пик – пик, высота которого больше 1/3 средней пиков в электрофореграмме.

Полученная общая нуклеотидная последовательность должна быть проанализирована на наличие:

• стоп-кодонов,

• делеций/инсерций,

• нетипичных оснований,

• сдвигов рамок считывания,

• присутствие в смеси нескольких штаммов.

Идентификация каждой мутации должна быть заверена дважды. После получения анализа консенсусной нуклеотидной последовательности, в случае обнаружения мутаций резистентности, необходимо вернуться к рассмотрению электрофореграмм на позицию аминокислоты, в которой была обнаружена мутация резистентности, и пересмотреть полученные данные (непосредственно пики электрофореграмм).

Для каждой обнаруженной мутации должна быть оценена достоверность ее идентификации. Результаты анализа должны быть заверены ответственным лицом после экспертного пересмотра данных.