1. Биуретовая реакция.

Принцип. Биуретовая реакция открывает пептидную связь (-СО-NН) в белке. В щелочной среде раствор белка при взаимодействии с ионами меди приобретает сине-фиолетовый цвет, а низкомолекулярные пептиды дают розовое окрашивание. Биуретовая реакция обусловлена образованием биуретового комплекса в результате соединения меди с пептидной группировкой белка.

Ход работы. К 5 каплям раствора белка прибавляют 5 капель едкого натра и одну каплю раствора сульфата меди. При встряхивании содержимое окрашивается в сине-фиолетовый цвет.

2. Ксантопротеиновая реакция.

Принцип. Ксантопротеиновая реакция открывает наличие циклических аминокислот тирозина и триптофана. При обработке раствора белка концентрированной азотной кислотой в ходе реакции нитрования образуются нитропроизводные указанных аминокислот желтого цвета. В щелочной среде образуются соли хиноидной структуры оранжевого цвета.

Ход работы. К 5 каплям раствора белка добавляют 3 капли концентрированной азотной кислоты и нагревают содержимое до появления желтой окраски. После охлаждения при добавлении 10 капель раствора едкого натра развивается оранжевая окраска.

3. Реакция миллона.

Принцип. Реакция Миллона открывает наличие тирозина. При нагревании с реактивом Миллона (раствор азотнокислых солей окиси и закиси ртути в азотной кислоте) образуется нитропроизводное тирозина, которое, присоединяя ртуть, превращается в ртутную соль нитротирозина розового цвета.

Ход работы. К 5 каплям раствора белка добавляют 2 капли реактива Миллона. После осторожного нагревания появляется розовый осадок.

4. Реакц ия адамкевича.

Принцип. Реакция Адамкевича открывает наличие триптофана. Реакция обусловлена взаимодействием триптофана с глиоксилевой кислотой в присутствии ледяной уксусной кислоты. Две молекулы триптофана, реагируя с глиоксилевой кислотой, образуют соединение красно-фиолетового цвета.

Ход работы. К 5 каплям раствора белка добавляют 10 капель ледяной уксусной кислоты. После нагревания наслаивают 10 капель концентрированной серной кислоты. Через некоторое время на границе двух слоев образуется красно-фиолетовое кольцо.

5. Реакция фоля.

Принцип. Реакция Фоля открывает наличие цистеина. Цистеин, освобождающийся при гидролизе белка, взаимодействует с едким натром с образованием сульфида натрия. Взаимодействие сульфида натрия с плюмбитом натрия (который образуется в ходе реакции уксусно-кислого свинца и едкого натра) приводит к выпадению в осадок сульфида свинца бурого или черного цвета.

Ход работы. К 5 каплям раствора белка добавляют 5 капель едкого натра и 1 каплю уксусно-кислого свинца. При нагревании смесь темнеет вследствие выпадения в осадок сульфида свинца.

Результаты занести в таблицу.

Отчет по лабораторной работе «Цветные реакции на белки и аминокислоты»

№№	Название реакции	Используемые реактивы	Наблюдаемые изменения	Что открывает данная реакция
1.	Биуретовая реакция
2.	Ксантопротеиновая реакция
3.	Реакция Милона
4.	Реакция Адамкевича
5.	Реакция Фоля

α – АМИЛАЗА

НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ α – АМИЛАЗЫ В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ И МОЧЕ ОПТИМИЗИРОВАННЫМ ЭНЗИМАТИЧЕСКИМ КИНЕТИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

α – АМИЛАЗА-02 ВИТАЛ Кат. № В 11.02

α – АМИЛАЗА -12 ВИТАЛ Кат. № В 11.12

α – АМИЛАЗА 22 ВИТАЛ Кат. № В 11.22

Настоящий набор реагентов относится к серий «Витал- FL-E», скомпонованной в соответствий с международными требованиями. Метод является рефератным.

Принцип метода:

Под действием α – амилазы защищенный синтетический суьстрат EPS [4,6 этилиден (G₇) -п-нитрофенил(G₁)-α,D-мальтогептаозид] гидролизуется с оброзаванием безцветных нитрофенилмальтоозидов. Под действием α – глюкозидазы нитрофенилмальтоозиды гидролизуется до глюкозы и окращенного п- нитрофенола. Скорость нарастания концентраций п-нитрофенола пропорциональна активности фермента.

Исследуемый материал:

Сыворатка/плазма крови (без цитрата, оксалата, фторида, ЭДТА),моча.

Состав набора:

Реагент №1. Буфер конечная концентрация

HEPES………………………………100ммоль/л,рН7,1

NaCl…………………………………..50ммоль/л

MgCl_{2…………………………………………………..10ммоль/л}

α –глюкозидаза………………………2 500 U/л

Реагент №1. Субстрат

EPS…………………………………...5ммоль /л

Аналитические характеристики набора

Линейность………………………………………до 1320ед/л.

Значение коэффицента вариаций………………………не более 5%

Время инкубаций……………………………………..2 мин +0,3- 3,0 мин

Температура инкубаций………………………………25°С,30°С или 37°С

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность:

Невскрытые реагенты стабильны 18 месяцев при темпиратуре 2-8°С. Дата изготовления. Серия и каталожный номер указаны на упаковке.

Рабочий реагент: перед проведением анализа смешайте необходимое количество реагентов №1 и №2 в соотношений 4+1. Полученный реагент стабилен 10 дней при темпиратуре хранения 2- 8 °С Плотно закрывайте флаконы сразу же после использования.

АНАЛИЗ

Фотометрирование: кювета -1см, λ=405 нм. Против воды или рабочего реагента. Перед измерением нагрейте рабочий реагент до температуры проведения анализа.

Смешайте рабочий реагент и анализируемый образец в соотношений:

Сыворотка/плазма: 100+4, например 1,0 мл реагента + 0,04 мл образца.

Моча:100+2, например 1,0 мл реагента +0,02 мл образца.

Тщательно перемешайте и инкубируйте при выбранной температуре (2 мин при 37°С или 3 мин при 25/30°С). Измерьте начальную экстинкцию и определяйте изменения экстинкций за 1 минуту(Д/Е мин) в течение последующих 3 минут. (При работе на автоматических анализаторах возможно измерение экстинкций за более короткое время, например, 20 секунд, с последующим автоматическим вычислением Д\Е мин.)

Расчет активности α – амилазы проводят по формуле:

Сыворотка/плазма: Активность * [ед/л ] = 2476 ×ДЕ/мин или [нмоль/с×л] = 41275 ×ДЕ /мин *1U/л = 16,67 нмоль(с.л)

Моча: Активность * [ед/л ] = 6067 × ДЕ/мин или [нмоль/с×л] =101137 × ДЕ/мин

*нормальные величины:

	25°С	30°С	37°С
Сыворотка/плазма	До60ед/л	до 80ед/л	До110ед/л
	До1000нмоль/схл	До1334 нмоль /схл	До1835 нмоль/схл
Моча	До 600ед/л	До 800 ед/л	До 1000ед/л
	До10 000 нмоль /схл	До13 300 нмоль /схл	До 16 670 нмоль /схл
Моча /24 часа	До 450 ед/л	До 650 ед/л	До 900 ед/л
	До7 500 нмоль /схл	До 10 840 нмоль /схл	До 15 000 нмоль /схл

*рекомендуется в каждой лабораторий уточнить диапазон значений нормальных величин для обследуемого контингента людей.

ВНИМАНИЕ: Для предохранения реагентов от контакта со слюней и кожей, которые содержат α-амилазу-никогда не пипетируйте ртом, открывайте флаконы с реагентами, надев защитную маску и резиновые перчатки.

ВНИМАНИЕ: Коэффицент расчета активности может различаться в разных сериях в связи с тем, что свойства входящей в набор α – глюкозидазы могут варьировать в различных партиях фермента.Всегда внимательно читайте описание к каждому конкретному набору.