2.1.3 Порядок выполнения работы

Продолжительность работы 4 ч.

Студенты определяют в исходном сырье (картофель, морковь) содержание фермента каталазы. Затем сырье нарезают кубиками с размерами граней 5-10 мм, проводят бланширование в воде и 0,2 %-ном растворе лимонной кислоты в течение 5-10 мин при температуре 95-97 ⁰С и снова определяют активность каталазы.

Активность фермента каталазы выражают микромолями перекиси водорода, разлагаемой 1 г исследуемого вещества при температуре 20 ⁰С в течение 1 мин.

Оптимальное значение рН действия каталазы равно 7,0. При рН ниже 3,0 фермент разрушается.

2.1.3.1 Определение активности каталазы

Активность фермента каталазы определяют по методике А.Н. Баха и А.И. Опарина. Количественное определение каталазы основано на учете перекиси водорода путем титрования ее перманганатом калия. Реакция протекает по уравнению:

2 KMnO₄ + 5H₂O₂ + 4H₂SO₄ 2KHSO₄ + 2MnSO₄ + 8H₂O + 5O₂

О количестве перекиси водорода, разрушенной ферментом, судят по разности количества (в см³) раствора KMnO₄ концентрацией 0,1 моль/дм³, израсходованного на титрование в контрольном и рабочем опытах.

Приборы и оборудование: весы аналитические, термостат, электрическая плитка; бюретка для титрования; терка.

Посуда и материалы: мерная колба на 200 см³; коническая колба на 250 см³; воронка; фильтровальная бумага; конические колба на 100-150 см³ – 4 шт.; пипетки; стеклянный стакан термостойкий; мерный цилиндр

Реактивы: толуол – 3 см³; 1 %-ный раствор Н₂О₂ – 12 см³; раствор NaОH концентрацией 0,1 моль/дм³ – 15 см³ (для нейтрализации); 10 %-ный раствор H₂SO₄ – 20 см³; раствор KMnO₄ концентрацией – 0,1 моль/дм³ – 10 см³

Расход сырья: картофель, морковь по 10 г

Техника определения

Сначала готовится вытяжка. Для этого на аналитических весах взвешивают 4 г измельченного картофеля (или моркови), количественного переносят навеску в мерную колбу вместимостью 200 см³. Добавляют 2-3 капли толуола и оставляют для настаивания на 1 ч в термостате при температуре 30 ⁰С. После настаивания жидкость отфильтровывают через складчатый фильтр и в фильтрате сразу же определяют каталазу.

Отбирают 4 пробы прозрачного фильтрата по 20 см³ каждая: 2 опытные и 2 контрольные. Контрольные пробы кипятят 5 мин на сетке для инактивации фермента.

К опытным и контрольным пробам добавляют по 20 см³ дистиллированной воды, по 3 см³ 1 %-ного раствора перекиси водорода, предварительно нейтрализованной раствором NaOH концентрацией 0,1 моль/дм³, и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. По истечении 30 мин к пробам прибавляют по 5 см³ 10 %-ного раствора серной кислоты и оставшуюся перекись водорода титруют раствором KMnO₄ концентрацией 0,1 моль/дм³.

Об активности каталазы судят по количеству мг перекиси водорода, которое разрушилось в течение 30 мин ферментом, содержащимся в 1 г исследуемого материала.

Активность каталазы (А_к) определяется по формуле 2.1.

А_к = 2.1

где: a – количество раствора KMnO₄ концентрацией 0,1 моль/дм³, израсходованного для титрования контроля, см³;

b - количество раствора KMnO₄ концентрацией 0,1 моль/дм³, израсходованного для титрования опытной пробы, см³

1,7 – коэффициент, показывающий, что 1 см³ раствора KMnO₄ концентрацией 0,1 моль/дм³ эквивалентен 1,7 мг Н₂О₂;

n – навеска исследуемого материала, г (в данном опыте при навеске 4 г, которая настаивалась в мерной колбе на 200 см³, и взятом на определение 20 см³ фильтрата навеска равна: (4*20)/200 = 0,4 г.