Иммунокомплексный тип реакции

2. Изучить иммунопатогенез системной красной волчанки (зарисовать схему 18, оформить протокол).

Схема 18

Генетические ф акторы		Ф акторы окружающей среды
Вовлечение несколько генов, включая HLA-DR-2 DR-3, C4a	Нарушение иммунной регуляции, модификация а утоантигенов	УФ облучение Лекарственные вещества Химические агенты Токсины Пищевые факторы Стрессы Инфекционные агенты
	П отеря толерантности к аутоантигенам П оликлональная активация В-клеток	Гормональные факторы
Продукция п атогенных а утоантител		Образование иммунных комплексов
		Нарушение процессов выведения ИК Дефицит компонентов комплемента С нижение на эритроцитах CR (рецепторов к С3b компоненту комплемента)
	Воспаление и б олезнь	Отложение ИК Активация макрофагов Нарушение цитокинового профиля

Схема иммунопатогенез СКВ

Классическим примером иммунокомплексной патологии является системная красная волчанка. При этом заболевании образующийся комплекс аутоантител с нуклеиновыми кислотами и гистонами оседает повсеместно на стенках малых сосудов и почечных клубочков, что приводит к поражению разных типов тканей в виде их деструкции, особенно опасных в тех случаях, когда комплекс локализуется в почках или мозге.

При СКВ наблюдаются поражения разных органов и систем, включая поражение суставов в виде волчаночного артрита, поражение мышц (миозит), наличие лихорадки, поражение кожи и сосудов (эритема на лице в виде «бабочки»), поражения ногтей и кончиков пальцев в виде атрофии и рубцевания, поражения сердца (миокардит, перикардит, эндокардит), поражения почек (гломерулонефрит), поражения легких, системы кроветворения и прочее.

Для специфической диагностики СКВ используют определение LE-клеток, антинуклеарных антител методом иммунофлюоресценции, обнаружение ревматоидного фактора. Обострение СКВ сопровождается ускорением СОЭ, повышением содержания гамма-глобулинов, С- реактивного белка, снижением гемолитической активности системы комплемента и др. изменениями.

2. Изучить иммунопатогенез сывороточной болезни (составить схему, оформить протокол)

Впервые сывороточная болезнь описали Пирке и Шик в 1903 г., наблюдавшие ее после введения противодифтерийной сыворотки. Основные закономерности иммунологического ответа при сывороточной болезни изучены на экспериментальных моделях, в частности, при введении кроликам бычьего сывороточного альбумина (модель Диксона).

Сывороточная болезнь – симптомокомплекс, развивающийся в ответ на внутримышечное или внутривенное введение в организм человека чужеродной сыворотки (антигены), преимущественно гетерологичной и некоторых других лекарственных препаратов и природных соединений. Частота сывороточной болезни зависит от вида и дозы применяемого белкового препарата, степени его очистки и широты применения. Свойства антигена также влияют на частоту развития сывороточной болезни.

Сыворотки, введенные с профилактической или лечебной целью (противостолбнячная, против ботулизма, противодифтерийная, антирабическая, антилимфоцитарная), антирабический γ-глобулин, иммуноглобулины. Столбнячный анатоксин: в редких случаях – переливания крови, плазмы; гормоны – инсулин, АКТГ; низкомолекулярные вещества со свойствами гаптенов – пенициллин, цефалоспорины, сульфаниламиды и др.; яд насекомых, преимущественно перепончатокрылых.

Гетерологичными препаратами являются антитоксические сыворотки (против столбняка, стафилококковой инфекции, яда змей), антилимфоцитарные сыворотки. Большинство сывороток готовят из крови гипериммунизированных лошадей.

Белки этих сывороток и являются антигенами, вызывающими развитие сывороточной болезни. Лошадиная сыворотка, являющаяся наиболее частой причиной сывороточной болезни, содержит более 40 различных антигенных субстанций. Главными антигенами сыворотки, способными провоцировать сывороточную болезнь, выступают α- и β-глобулины. Используемые первоначально нативные лошадиные сыворотки были высокореактогенны и давали большое количество аллергических реакций. С применением различных способов очистки сывороток после удаления балластных белков их аллергенные свойства снизились. Выраженная аллергенность гетерологичных сывороток явилась важнейшей причиной замены их гомологичными белковыми препаратами (целая плазма крови или ее фракция – сывороточный альбумин, нормальный или специфический гамма-глобулин).

Обработка столбнячного анатоксина пепсином снижает его антигенность и соответственно возможность развития сывороточной болезни, не уменьшая терапевтической активности. Антирабическая сыворотка при такой обработке утрачивает и антигенность, и активность.

Аллергенность аллогенных препаратов намного ниже, чем у ксеногенных, но и они вызывают развитие сывороточной болезни и других аллергических реакций. Сенсибилизирующие свойства гамма-глобулина связаны с тем, что:

1) каждая его серия приготовлена из крови, взятой не менее чем от 1000 доноров, и, следовательно, каждый класс иммуноглобулинов представляет набор молекул, принадлежащих к разным аллотипам;

2) препараты, приготовленные из ретроплацентарной крови, содержат примесь А- и В-группоспецифических антигенов крови;

3) имеется тенденция к агрегации молекул иммуноглобулинов. Агрегация молекул белка может быть причиной осложнений и при введениях плазмы крови или сывороточного альбумина. Симптомы сывороточной болезни могут развиться и при введении некоторых лекарственных препаратов, содержащих белок животного происхождения (инсулин, АКТГ, экстракты печени).

Способ введения сыворотки имеет значение. При внутривенном введении сыворотки болезнь развивается чаще, чем внутримышечном. Сывороточная болезнь может быть вызвана и интраназальным введением. Возможно развитие спонтанной сенсибилизации при вдыхании лошадиной перхоти и других компонентов, имеющих антигенное родство с белками лошадиной сыворотки, или попадании их в организм энтеральным путем.

Частота сывороточной болезни зависит от вида и дозы применяемого белкового препарата, степени его очистки и широты применения.

Сывороточная болезнь часто развивалась в период применения нативных антитоксических сывороток. Так, при лечении дифтерии сывороточная болезнь отмечалась в 20–85% случаев, возрастая при повторных введениях сыворотки до 96%. При введении сывороток, очищенных путем ферментативного гидролиза, электродиализа и т.д. (по методам «Диаферм-3, «Просдис-2»), частота сывороточной болезни снизилась до 1–10%.

Реакции на препараты иммуноглобулинов отмечаются еще реже – в 0,036–0,06%. У грудных детей сывороточная болезнь встречается редко; с возрастом частота, интенсивность и тяжесть заболевания возрастают. Смертность при сывороточной болезни низкая – 1 случай на 50 000–100 000 введений сыворотки. Непосредственной причиной ее, как правило, является анафилактический шок. Считают, что около 10–12% людей имеют повышенную чувствительность к белкам лошадиной сыворотки.

Обычно после первого введения сыворотки или гамма-глобулина сывороточная болезнь не развивается. Через 3–7 суток после появления антител иммунные комплексы удаляются, антиген элиминируется из организма и больной выздоравливает. В крови продолжают циркулировать свободные антитела, титры которых постепенно снижаются. Сами антитела повреждающего действия не оказывают. 3. Изучить кинетику выведения антигена из организма человека (нарисовать график, оформить протокол).

Кинетика выведения антигена из организма состоит из трех фаз:

- установление равновесия между концентрацией антигена в крови и тканях, происходящее за счет выхода антигена в экстравазальное пространство и его последующей дезинтеграции (наблюдается в течение одного-двух дней после инъекции антигена, при этом его концентрация в сыворотке уменьшается на 60–80%);

- разрушение антигена ферментными системами сыворотки и элементами ретикулоэндотелия;

- связывание антигена вырабатывающимися антителами с образованием иммунных комплексов и привлечением комплемента системы (происходит на седьмой день с момента попадания в организм антигена).

Однако при повторных введениях сывороток создаются условия для ее возникновения. В развитии сывороточной болезни принимают участие несколько иммунных механизмов, из которых ведущим является повреждающее действие циркулирующих иммунных комплексов. Участие нескольких иммунных механизмов связано с тем, что на введение сыворотки идет образование антител, относящихся к разным классам иммуноглобулинов. Преципитирующие антитела принимают участие в образовании иммунных комплексов, реагины приводят к включению аллергической реакции немедленного типа, что вносит свой вклад в повышение проницаемости сосудов. При этом имеют значение свойства антигена и особенности иммунологической реактивности. Количество введенного антигена и динамика антителообразования определяют соотношение молекул в составе иммунных комплексов, от чего, в свою очередь, зависят свойства иммунных комплексов, влияющие на развитие и тяжесть сывороточной болезни. Поскольку формирование иммунных комплексов при сывороточной болезни происходит в случае избытка антигена, важное значение имеют скорость разрушения антигена и его доза.

Особенности реактивности организма влияют на частоту и тяжесть сывороточной болезни. Дети болеют реже, чем взрослые, заболевание у них протекает менее длительно и более доброкачественно. У лиц с атопией возможна перекрестная аллергия между антигенами сыворотки и аллергенами пищевыми (мясо), а также эпидермальными аллергенами.

На экспериментальных моделях сывороточной болезни была установлена важная роль индивидуальных особенностей антителообразования. При введении сыворотки у различных линий животных наблюдались три типа ответа: антитела не образовывались; происходило выраженное антителообразование; отмечалось слабое антителообразование. В первом случае сывороточная болезнь не развивалась, во втором развивалась, но симптомы быстро угасали по мере нарастания титра антител. Наиболее благоприятным фактором для сывороточной болезни является третий тип ответа – слабое антителообразование. При этом создаются условия для длительной персистенции иммунных комплексов и накопления их в тканях, особенно при повторном введении антигена. Количество введенного антигена и динамика антителообразования определяют соотношение молекул в составе иммунных комплексов, от чего, в свою очередь, зависят свойства иммунных комплексов, влияющие на развитие и тяжесть сывороточной болезни.

Образовавшиеся иммунные комплексы фиксируют на себе компоненты комплемента системы, уровень которых в сыворотке в этот период снижается. Антитела, входящие в состав иммунных комплексов, и отдельные компоненты комплемента, в частности анафилатоксины СЗa и С5b, привлекают вместо отложения иммунных комплексов нейтрофилы и макрофаги. При этом активируются лизосомальные ферменты и их выход в межклеточное пространство. Лизосомальные гидролазы, а также стимулированный ими выход других медиаторов, в частности, из тучных клеток, базофилов и тромбоцитов, вызывают местную воспалительную реакцию, направленную на инактивацию иммунных комплексов.

Основная роль в патогенезе сывороточной болезни принадлежит антителам, относящимся к иммуноглобулинам G и М, участвующим в образовании иммунных комплексов. Роль иммуноглобулина А мало изучена. Важное значение имеют антитела, относящиеся к иммуноглобулину Е и способствующие тканевому отложению иммунных комплексов. Если сывороточная болезнь протекает с явлениями анафилаксии, реакция, индуцированная иммуноглобулином Е, приобретает ведущее значение в патогенезе.

Иммунологическая стадия. В ответ на появление аллергена или антигена начинается синтез антител, преимущественно IgG- и IgM-классов. Эти антитела называют также преципитирующими за их способность образовывать преципитат при соединении с соответствующими антигенами.

При соединении AT с АГ образуются ИК. Они могут образовываться местно, в тканях, либо в кровотоке, что в значительной мере определяется путями поступления или местом образования антигенов (аллергенов). Патогенное значение ИК определяется их функциональными свойствами и локализацией вызываемых ими реакций.

От количества и соотношения молекул АГ и AT зависят величина комплекса и структура решетки. Так, крупнорешетчатые комплексы, образованные в избытке AT, быстро удаляются из кровотока ретикулоэндотелиальной системой. Преципитированные, нерастворимые ИК, образованные в эквивалентном соотношении, обычно легко удаляются при помощи фагоцитоза и не вызывают повреждения за исключением случаев их высокой концентрации или образования в мембранах с фильтрующей функцией (в гломерулах, сосудистой оболочке глазного яблока). Небольшие комплексы, образованные в большом избытке антигена, циркулируют длительное время, но обладают слабой повреждающей активностью. Повреждающее действие обычно оказывают комплексы растворимые, образованные в небольшом избытке антигена, м.м. 900000- 1000000 Д. Они плохо фагоцитируются и долго находятся в организме.

Значение вида антител определяется тем, что разные классы и подклассы обладают различной способностью активировать комплемент и фиксироваться через Fс и Сз-рецепторы на фагоцитирующих клетках. Так, IgM-, IgG-антитела связывают комплемент, а IgE и IgG4 - нет.

При образовании патогенных ИК развивается воспаление различной локализации. Ингаляционные антигены способствуют, прежде всего, реакциям в альвеолярных капиллярах (аллергический альвеолит). При ревматоидном артрите локализацию определяют выработка ревматоидного фактора и присутствие его в синовиальной жидкости. Решающую роль для циркулирующих в крови ИК играют проницаемость сосудов и наличие определенных рецепторов в тканях, например, к СЗ на гломерулярной базальной мембране.

Патохимическая стадия. Под влиянием ИК и в процессе его удаления образуется ряд медиаторов, основная роль которых заключается в обеспечении условий, способствующих фагоцитозу комплекса и его перевариванию. Однако при неадекватности сложившихся условий процесс образования медиаторов может оказаться чрезмерным, и тогда они начинают оказывать и повреждающее действие.

Основными медиаторами являются:

1. Комплемент, в условиях активации которого различные компоненты и субкомпоненты оказывают цитотоксическое действие. Ведущую роль играет образование СЗ, С4, С5, которые усиливают определенные звенья воспаления (СЗb усиливает иммунную адгезию ИК к фагоцитам, СЗа играет роль анафилатоксина, как и С4а, и т. д.). 2. Лизосомальные ферменты, освобождение которых во время фагоцитоза усиливает повреждение базальных мембран, соединительной ткани и т. д.

3. Кинины, в частности брадикинин. При повреждающем действии ИК происходит активация фактора Хагемана; в результате из альфа-глобулинов крови под влиянием калликреина образуется брадикинин. 4. Гистамин, серотонин играют большую роль в аллергических реакциях III типа. Источником их являются тучные клетки, тромбоциты и базофилы крови. Они активируются СЗа- и С5а-компонентами комплемента. 5. Супероксидный анион-радикал также принимает участие в развитии реакции этого типа. Действие всех перечисленных основных медиаторов характеризуется усилением протеолиза.

Патофизиологическая стадия. В результате появления медиаторов развивается воспаление с альтерацией, экссудацией и пролиферацией. Развиваются васкулиты, что приводит к появлению узловатой эритемы, узелкового периартериита, гломерулонефрита. Могут возникать цитопении (например, гранулоцитопении). Вследствие активации фактора Хагемана или/и тромбоцитов иногда происходит внутрисосудистое свертывание крови.

Сывороточная болезнь может развиваться и без участия антител. Это бывает в тех случаях, когда вводятся препараты гамма-глобулина или сыворотки, в которых произошло образование комплексов за счет полимеризации молекул иммуноглобулина, особенно, если эти препараты вводят внутривенно.

Агрегированные препараты, обладая не только антигенными свойствами, но и выраженной биологической активностью и антикомплементарностью, могут вызывать псевдоаллергические реакции. Неспецифическая биологическая активность препаратов иммуноглобулинов обусловлена присутствием в них витаминов, ферментов, гормонов. Несмотря на очень низкие концентрации, они могут участвовать в реакциях в качестве катализаторов биологических процессов. В этих случаях сразу же происходит активация комплемента, освобождение гистамина со всеми последующими изменениями и быстрым развитием анафилактоидных реакций.

Клинические проявления сывороточной болезни наблюдаются на 7–15-й день. Симптомы сывороточной болезни отличаются выраженным полиморфизмом. Основные данные о морфологической картине сывороточной болезни получены на экспериментальных моделях.

При острой сывороточной болезни нарушения связаны с отложением растворимых иммунных комплексов вдоль и внутри стенок сосудов почечных клубочков.

При хронической форме сывороточной болезни морфологическая картина характеризуется проявлениями системного артериита с вовлечением в процесс венул. Наиболее часто поражаются сосуды почек, а также коронарные и легочные.

4. Изучить иммунопатогенез аллергического васкулита (составить схему, зарисовать)

Аллергические васкулиты – группа аллергических заболеваний, вызванных системным воспалительным поражением кровеносных сосудов. Аллергические васкулиты могут иметь первичный характер, определяющий развитие отдельных нозологических форм, и вторичный – при коллагеновых болезнях, инфекционных заболеваниях. В возникновении аллергических васкулитов имеют значение аллергия лекарственная, пищевая и микробная, аутоиммунные процессы, важная роль принадлежит вирусным инфекциям. В большинстве случаев этиологический фактор аллергических васкулитов выяснить невозможно. Аллергические васкулиты различаются по анатомической локализации и калибру пораженных сосудов, степени вовлеченности в процесс органов и тканей, иммунологической картинах воспаления.

Аллергические васкулиты, можно подразделить на две группы.

1. Острые непрогрессирующие поражения при однократных либо повторных аллергических реакциях с обратимыми иммунологическими нарушениями (инфекционные, лекарственные и пищевые аллергические васкулиты, а также аллергические васкулиты, возникающие под действием пневмоаллергенов).

2. Хронические прогрессирующие аллергические васкулиты, в основе которых лежат труднообратимые или необратимые иммунологические нарушения. Эти нарушения проявляются рецидивирующими аллергическими реакциями при коллагеновых болезнях (ревматизм, артрит ревматоидный, волчанка красная системная, склеродермия системная).

Помимо клинической картины первая и вторая группы аллергических васкулитов различаются особенностями иммунологического гомеостаза. Некоторые из этих различий связаны с особенностями иммунного ответа, определяющими повышенное образование иммунных комплексов и их фиксацию в сосудистой стенке (сывороточная болезнь, болезни иммунных комплексов).

Основная роль в патогенезе аллергических васкулитов отводится образованию ИК, при отдельных формах аллергических васкулитов – образованию цитотоксических антител с тропностью к сосудистой стенке. При некоторых формах аллергических васкулитов (в частности, при периартериите узелковом) имеют место реакции, индуцированные иммуноглобулином Е.

Значительная роль принадлежит гиперчувствительности замедленного типа: лимфоциты с цитотоксической активностью присутствуют в составе инфильтрата, антигены сосудистой стенки стимулируют РБТЛ больных аллергическим васкулитом.

При морфологическом исследовании в стенке пораженного сосуда обнаруживается диффузная инфильтрация нейтрофилами, моноцитами или образование воспалительных гранулем. Деструкция инфильтрирующих клеток приводит к отложению ядерного материала на участке поражения (лейкопластический васкулит). Развитие гиперергического воспаления вызывает дезорганизацию элементов сосудистой стенки, геморрагическое пропитывание, фибриноидный некроз с последующими тромботизацией, окклюзией и склерозом сосуда.

Клиника аллергических васкулитов отличается у разных нозологических форм. В зависимости от особенностей патогенеза и клиники больным аллергическим васкулитом назначают иммунодепрессивные препараты с целью подавления иммунопатологического процесса или глюкокортикостероидные препараты с учетом их иммунодепрессивного действия и противовоспалительных эффектов.

С помощью плазмафереза и гемосорбции очищают жидкую часть крови от ЦИК, агрессивных антител, медиаторов аллергии.

5. Изучить метод определения ЦИК (составить алгоритм реакции, записать в тетрадь, оформить протокол).

Образование иммунных комплексов сопровождает лю­бой иммунный ответ. При нормальном состоянии иммунной системы образовавшиеся комплексы «АГ+АТ» фагоцитиру­ются и удаляются из организма. При патологических состоя­ниях (недостаточность фагоцитоза и др.) ИК, состоящие из аутоантител, аутоантигенов, компонентов комплемента и др., могут откладываться в тканях, на стенках сосудов и т.д., вы­зывая синдром иммунокомплексной патологии. ИК способны активизировать систему комплемента с последующим разви­тием агрессивных реакций. В связи с этим обнаружение ЦИК и определение его состава имеет важное клиническое значе­ние. Существует несколько методов определения ЦИК: пре­ципитация, турбодиметрия, термистография, ИФА и др.

Ме­тод преципитации ЦИК с последующим их типированием наиболее распространен в лабораториях клинической имму­нологии. Принцип метода. Раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) способен осаждать из сыворотки агрегированные иммунные глобулины и иммунные комплексы. Различные концентра­ции ПЭГ (2,5; 3,5%; 7% и 10%) вызывают преципитацию различных по молекулярной массе и размерам иммунных комплексов. Низкие концентрации ПЭГ осаждают комплек­сы крупных размеров, высокие концентрации вызывают пре­ципитацию низкомолекулярных соединений. 3,5% ПЭГ преципитирует наиболее распространенные (промежуточные) комплексы средних размеров.

Техника постановки анализа. Анализ ЦИК прово­дится в 2 этапа:

1-й этап - выделение ЦИК,

2-й этап - типирование ЦИК.

1. Выделение ЦИК:

- развести в пробирках сыворотки пациентов боратным буфером из расчета 1:25 или 1:50; 50 мкл сыворотки + 1,2 мл боратного буфера или 100 мкл сыворотки + 2,5 мл боратного буфера;

- добавить в каждую пробирку с сывороткой пациентов 7% раствор ПЭГ в соотношении 1:1 (1,25 мл или 2,5);

- перемешать стеклянной палочкой, закрыть пробирки пробками. Поставить штатив с пробирками в холодиль­ник +4°С на 18 ч;

- после инкубации центрифугировать 30 мин при 3000 об/мин;

- после центрифугирования при наличии осадка (ЦИК) надосадочную жидкость слить, а обнаруженный ЦИК учесть по 4-плюсовой системе.

2. Типирование ЦИК:

- к осадку добавить 1,5 мл 3,5% ПЭГ, перемешать, пере­лить в пробирки типа «эппендорф» и центрифугировать 2 раза по 20 мин. на 8000 об/мин.;

- после первого центрифугирования надосадок слить и до­бавить 1 мл 3,5% ПЭГ;

- после второй промывки слить надосадок, тщательно вытряхнуть жидкость из пробирок типа «эппендорф» на фильтровальную бумагу. Добавить по 0,1 мл ЗФР, пере­мешать. Образцы готовы для внесения их в иммунодиф­фузионные планшеты;

- подготовить иммунодиффузионные планшеты (IgA, IgM, IgG);

- внести в иммунодиффузионные планшеты по 5–10 мкл контроль-ного образца (титр разведения указан на флако­не и в инструкции);

- внести в лунки планшета по 5–10 мкл образцов исследуе­мых сыво-роток;

- инкубировать при комнатной температуре 24 ч;

- провести измерение колец преципитации контрольного образца и исследуемых проб с помощью бинокулярной лупы на трех планшетах (IgA, IgM, IgG).

Учет результатов:

1. Построить калибровочную кривую зависимости величины диаметра преципитата от кон­центрации ЦИК. По­строить калибровочную кривую на каждую из трех план­шет (IgA, IgM, IgG);

2. Рассчитать значения концентраций компонентов ЦИК исследуемых образцов пациентов по калибровочной кри­вой.

У здоровых людей ЦИК в РИД – отрицательный.

5. Подведение итогов занятия - 5 мин

Практическое занятие 8

Тема. Иммунопатология. Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ). IV-тип гиперчувствительности по классификации Кумбса и Джелла. Классификация аллергенов. Иммунный пролиферативный ответ. Заболевания, развивающиеся по гиперчувствительность замедленного типа. Ревматоидный артрит. Оценка гиперчувствительности замедленного типа внутрикожными пробами и РТМЛ.

Цель занятия. Изучить механизм развития ГЗТ. Ознакомить студентов с иммунобиологическими препаратами (аллергенами), применяемыми для оценки гиперчувствительности замедленного типа