Иммуноглобулины класса g (IgG)

Примечание:

1 – носитель (поверхность лунки планшета);

2 – антиген;

3 – специфические IgG сыворотки крови;

4 – моноклональные анти-IgG–антитела, меченые пероксидазой хрена (конъюгат).

Принцип метода. Имму­ноферментный метод сменил иммунора-диометрический и имеет ряд преимуществ:

1. отсутствие контакта с радиоактивными веществами;

2. меньшие затраты на оборудование (высокая стоимость счетчи-ков);

3. устойчивость меченых соединений при хранении (не ме­нее 6 мес.);

4. возможность автоматизации процесса.

К недостаткам следует отнести:

1. канцерогенность и нестойкость некоторых ферментных субстра-тов (индикаторные смеси);

2. неспецифические помехи за счет ряда эндогенных фер­ментов, присутствующих в биоматериале или окружаю­щей среде.

В силу чрезвычайно мощной каталитической активно­сти фер-менты наиболее чувствительны и универсальны в ка­честве метки. В качестве ферментов-маркеров используются щелочная фосфатаза, ацетилхолинэстераза, бета-галактозидаза, пероксида-за хрена и т.д. Каталитическая активность ферментов различна и зависит от его конформационных свойств. Большинство используемых ферментов за 1 мин. при обычной температуре способны превращать в компонен­ты 10⁶ молекул субстрата в расчете на одну молекулу фер­мента. Из сказанного следует, что чувствительность реакции значительно зависит от каталитической эффективности фер­мента-маркера.

Иммунопероксидазные методы наиболее просты и эффективны при анализе срезов тканей, обнаружении анти­генов после электрофоретического разделения.

При ИФА, очень важным является этап отмывки несвязавшихся реагентов. Введение в систему МкАт повышает специфичность ИФА.

Существует множество модификаций метода ИФА, но наиболее известным и используемым в практике является гетерогенный ИФА. В качестве «твердой фазы» используют полистирол, полиэтилен, сефадекс, акриламид, целлюлозу, бумажный диск и др.

Среди гетерогенных методов различают конкурент­ный, неконкурентный, «сэндвич» (англ. sandwich – бутер­брод), ингибиторный прямой и непрямой. В лабораторной иммунологии в ручном варианте наиболее популярен неконкурентный сандвич метод. В последнее время выпускаются тест-системы, где в качестве твердой фазы используются различные материалы: бумажные диски, бусинки, парамагнитные частицы и др. Обязательным условием проведения ИФА является постановка контрольных материалов и калибраторов.

Контрольные материалы ставятся в каждой серии опытов.

Чувствительность ИФА высокая. Специфичность определяется чистотой антител, ис­пользуемых в системе. Автоматизация методов позволяет их стандартизиро­вать и увеличить объем исследований.

Методы широко используются в лабораторной клини­ческой иммунологии для диагностики инфекционной пато­логии, включая ВИЧ-инфекцию, дефектов гуморального и клеточного звеньев иммунной системы, в аутоиммунной патологии и в массовых эпидемиологических исследованиях .

5. Подведение итогов занятия – 5 мин