Определение титра токсина

Токсин в мл	0,10	0,15	0,20	0,25	0,30
Стандартная сыворотка в мл	1	1	1	1	1
День гибели		4-е сутки

Limes tod = 0,15

2 этап – опытную смертельную дозу токсина соединяют с различными количествами испытуемой сыворотки (разведенной), смеси вводят морским свинкам и вновь наблюдают гибель одной из морских свинок на 4-е сутки.

При постановке реакции в организме можно предварительно опытному животному ввести антитоксическую сыворотку, а потом ввести оттитрованную дозу токсина. Контрольному животному вводят только токсин, и оно погибает, так как в организме нет антител. Вариантом постановки реакции нейтрализации в организме является определение уровня антитоксического иммунитета путем постановки внутрикожных проб с токсином (пробы Шика, Дика и др.) Нейтрализация токсина антитоксином может быть определена в чашках Петри методом преципитации в геле. Эта модификация используется для обнаружения токсигенности культур дифтерийных палочек, стафилококков и др. Токсигенность выявляют по линиям преципитации, которые появляются в агаре в результате взаимодействия токсина, образуемого исследуемой культурой и диффундирующего в агар и антитоксина, также диффундирующего в агар из места его нанесения.

Присутствие токсина, а также его силу можно определить пробирочным методом в реакции флоккуляции.

4. Изучить реакцию флоккуляции (записать в тетрадь, оформить протокол).

Реакция флоккуляции (таблица 7) основана на способности смеси токсина с антитоксической сывороткой в определенных условиях опыта давать помутнение и выпадать в осадок. Реакция была предложена Рамоном. Основным условием для визуального проявления реакции является эквивалентные соотношения антигена и антитела. Раньше всего реакция наступает там, где количество единиц токсина соответствует количеству единиц антитоксина. Примечательным является также и то, что реакция флоккуляции произойдет, если в качестве антигена используется и анатоксин. Анатоксин – это обезвреженный токсин, который получают из экзотоксина путем обработки его 0,3–0,4% раствором формалина при температуре 37–40°С в течение 18–30 дней. В результате такой обработки токсин теряет свои ядовитые свойства, но сохраняет антигенные. Сила анатоксина измеряется в антигенных единицах связывания (ЕС). Реакция флоккуляции используется в вакцинном производстве для титрования анатоксина.

Для титрования полученный анатоксин разливают в пробирки по 2 мл, в каждую пробирку добавляют стандартную антитоксическую сыворотку в определенной дозе и определенной силы от 0,2 до 1,6 мл (например: противодифтерийная сыворотка с титром 1000 АЕ, разведение 1:10). Смесь помещают на водяную баню при 45°С на 40–45 мин и наблюдают, в какой из пробирок произойдет инициальная или начинающаяся флоккуляция.

Например: инициальная флоккуляция произошла в пробирке №3.

Силу анатоксина вычисляем следующим образом: для связывания 2 мл анатоксина потребовалось 60 МЕ сыворотки (1 мл сыворотки содержит 100 АЕ, 0,6 мл содержат 60 АЕ), на 1 мл – х, составляем пропорцию:

2,0 – 60 АЕ

1,0 – х х=60:2=30 АЕ

Таблица 7

Схема реакции флоккуляции

№№ пробирок	1	2	3	4	5	6
Анатоксин	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0
Антитоксическая противодифтерийная сыворотка, т. 1000 АЕ, разв.	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0	1,2
			инициальная или начинающаяся флоккуляция

Вывод: в 1 мл анатоксина содержится 30 ИЕ. За 1 ИЕ (иммуногенную единицу) или ЕС принимают то количество анатоксина, которое в смеси с 1 АЕ сыворотки дает инициальную флоккуляцию.

5. Изучить список вакцин и сформировать по видам (записать в тетрадь, оформить протокол):

живые, инактивированные (убитые), вакцины-анатоксины, химические вакцины, рекомбинантные (генно-инженерные) вакцины, ассоциированные вакцины, вакцины, применяемые с лечебной целью: против туберкулеза (BCG), против желтой лихорадки, против эпидемического паротита, против кори, против краснухи, против бруцеллеза, против гриппа, против сибирской язвы, против чумы, против туляремии, против Ку-лихорадки, против полиомиелита, против коклюша, против холеры, против бруцеллеза, против лепры, против лептоспироза, против гонореи, против гриппа, против бешенства, против клещевого энцефалита, противодифтерийные, протистолбнячные, противостафиллококовые, против холеры, против ботулизма (А, В, С, Д, Е), против раневой анаэробной газовой инфекции, против брюшного тифа, против менингококковой инфекции, против гриппа,против гемофильной инфекции, против гепатита В, АКДС, АДС-м, секстаанатоксин, против бруцеллеза, против гонореи, аутовакцина для лечения хронической стафилококковой инфекции, противостафилококковые.

6. Изучить антигенспецифическую и антигеннеспецифическую активацию иммунной системы по схеме (зарисовать схему 10, оформить протокол)

Схема 10

Антигенспецифическая и антигеннеспецифическая

активация иммунной системы

7. Изучить схему получения моноклональных антител (записать в тетрадь схему 11, оформить протокол)

Примечание:

А, В, С – многокомпонентная смесь антигенов, использованная для иммунизации (или сложные антигены с множеством антигенных детерминант);

АОК – антителообразующие клетки селезенки;

Пл – клетки плазмоцитомы, не растущие в селективной ГАТ-среде;

ПЭГ – полиэтиленгликоль;

ГАТ – среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин, тимидин;

анти-А, анти-В, анти-С - моноклональные антитела соответственно, к

А-, В-, С-антигенам (или антигенным детерминантам).

7. Подведение итогов занятия – 5 мин.

Схема 11

Получение гибридом (Г. И. Абелев, 1998)

Практическая работа 4

Тема. Гиперчувствительность немедленного типа (ГНТ) (В-зависимая аллергия). Аллергены. Классификация аллергенов. Аллергическая реакция I типа, её механизмы. Определение общего IgE и аллергенспецифических IgE в сыворотках крови методом ИФА

Цель занятия. Освоить понятие ГНТ, механизм развития. Ознакомить с классификацией аллергенов. Изучить принцип постановки ИФА для определения IgE в сыворотках крови