32. Хроматография, ее виды, использование в фармацевтическом анализе.

Хроматографические методы разделения веществ основаны на их распределении между двумя фазами: подвижной и не­подвижной. Подвижная фаза — жидкость или газ; неподвижная — твердое вещество или жидкость, адсорбированная на твердом носителе. Относительная скорость перемещения частиц вдоль пути разделения зависит от их взаимодействия с неподвижной фазой. Поэтому каждое вещество проходит на носителе определенный путь. Отношение пути перемеще­ния вещества к пути перемещения растворителя есть величина постоянная, обозначаемая Rf. Она является константой для данных условий разделения и используется для идентификации ЛВ.

Виды хроматографии:

1. По агрегатному состоянию подвижных фаз: жидкостная Х, ВЭЖХ, ГЖХ, газовая Х.

2. По механизму разделения: ионообменная, распределительная, осадочная.

3. По способу проведения (аппаратурного оформления): колоночная, планарная (плоскостная) – бумажная, тонкослойная.

Хроматография на бумаге. Носителем неподвижной фазы (например, воды) служит специальная хроматографическая бумага. Распределение происходит между водой, находящейся на поверхности бумаги, и подвижной фазой, которая пред­ставляет собой систему из нескольких растворителей. Испытание выполняют согласно требованиям ГФ XI или ФС (ФСП). Для подтверждения подлинности одновременно хроматографируют испытуемое вещество и стандартный об­разец. Если они идентичны, то пятна на хроматограммах будут иметь одинаковый вид и равные значения Rf. Чтобы ис­ключить влияние на ошибку определения условий хроматографирования, пользуются более объективной константой Rs, которая представляет собой отношение величин Rf испытуемого и стандартного образцов. Хроматографию используют при испытании на чистоту. О наличии примесей судят по появлению дополнительных пятен на хроматограмме. Анализи­руемое вещество и примесь обычно имеют разные значения Rf.

Количественное содержание вещества можно определить непосредственно на хроматограмме, используя планиметри­ческий, денситометрический, люминесцентный и другие методы. Используют также способы, основанные на элюировании анализируемого вещества из вырезанного и измельченного участка хроматограммы с соответствующим пятном. В элюате содержание испытуемого вещества определяют фотометрическим или электрохимическим методом.

Хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ) отличается от хроматографии на бумаге тем, что процесс хроматографирования происходит на носителе (сорбенте), нанесенном тонким слоем на инертную поверхность. Твердый сорбент может быть закрепленным или незакрепленным на этой поверхности. Сорбентом служит силикагель или оксид алюминия. Для закрепления добавляют небольшие количества крахмала или сульфата кальция. Используют также пластинки промышленного изготовления типа «Силуфол УФ-254», «Сорбфил» и др.

Преимуществами ТСХ является простота приемов и оборудования, более высокая чувствительность, чем у бумажной хроматографии, устойчивость пластинок к температурным и химическим воздействиям, значительно большие возможно­сти процессов разделения, детектирования, элюирования, меньшая продолжительность выполнения испытания. Все это создает широкие возможности в использовании ТСХ для выполнения испытаний на подлинность, чистоту, для количест­венного определения ЛВ в ЛФ.

Двумерное хроматографирование отличается повторным (после высушивания) пропусканием той же или иной по­движной фазы, но в перпендикулярном по отношению к первоначальному направлении. При этом используют квадрат­ные пластины или листы бумаги.

В фармацевтическом анализе широко применяют сочетание ТСХ с физико-химическими методами анализа. Такие комбинированные методы, как хромато-спектрофотометрия, хромато-флуориметрия, хромато-масс-спектроскопия осо­бенно эффективны в анализе ЛPC и препаратов, содержащих большое число сопутствующих компонентов.

Газожидкостиая хроматография (ГЖХ) основана на распределении компонентов смеси между газовой и жидкой или твердой фазами. Распределение происходит в результате многократных актов сорбции и десорбции анализируемых ве­ществ, которые вводятся в поток газа-носителя, испаряются и в парообразном состоянии проходят через колонку с сор­бентом. Поэтому метод ГЖХ применим для анализа летучих веществ или веществ, которые могут быть переведены в газообразное состояние. Разделенные вещества элюируются из колонки потоком газа-носителя, регистрируются детектором и фиксируются на хроматограмме в виде пиков, по которым можно идентифицировать или определять содержание каж­дого компонента смеси.

Газовый хроматограф включает в себя систему измерения и регулирования скорости потока газа-носителя, систему вво­да пробы испытуемого образца, газохроматографическую колонку, систему термостатирования и контроля температуры в различных узлах прибора и систему детектирования, регистрации и обработки информации, полученной на приборе.

Подлинность ЛВ методом ГЖХ можно подтвердить либо с помощью веществ-свидетелей, либо методом относительных удержи­ваний. В первом случае доказательством идентичности служит совпадение времени удерживания вещества-свидетеля и од­ного из компонентов смеси ЛВ при хроматографировании каждого в отдельности в одинаковых условиях. Во втором случае вещество-свидетель добавляют к пробе, затем анализируют по рекомендуемой методике. Рассчитывают по формуле вели­чину относительного удерживания, которая является постоянной для ЛВ в конкретных условиях. Количественный анализ выполняют в тех же условиях, используя для расчетов такие параметры, как площадь или высота пиков ЛB. Площадь пиков устанавливают на хроматограмме с помощью планиметра, интегратора или умножением высоты пика на его полуширину.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) отличается от ГЖХ тем, что подвижной фазой служит не газ, а жидкость, причем она проходит через колонку, наполненную сорбентом, с большой скоростью за счет значительного дав­ления. Поэтому ВЭЖХ позволяет разделять многокомпонентные смеси на индивидуальные вещества высокой степени чис­тоты. ВЭЖХ отличается высокой чувствительностью (до 10^-6 г). На разделение 10-15 компонентов затрачивается 20-30 мин. Жидкостный хроматограф включает такие узлы, как дозатор, насос высокого давления, высокоэффективную колонку, детектор с регистрирующим устройством. Колонки изготавливают из нержавеющей стали, они имеют длину 10-25 см, вну­тренний диаметр 0,3-0,8 см и плотно набиваются адсорбентом с размером частиц 5-10 мкм. В качестве элюента использу­ют различные углеводороды в сочетании с этанолом. Детектором обычно служит спектрофотометр с переменной длиной волны (190-900 нм), но существуют также флуориметрические, электрохимические и другие детекторы.

Подлинность испытуемых ЛВ подтверждают по времени выхода каждого компонента смеси из колонки, которое будет стабильно при одинаковых условиях проведения эксперимента. Количественное содержание рассчитывается по площади пика, которая пропорциональна количеству ЛВ в пробе.

t⁰ плавления – при наличии примесей понижается.

t⁰ разложения – для веществ, резко меняющих свои свойства; когда вещество резко начинает менять свои свойства: темнеть или выделять газ.

t⁰ плавления невозможно установить для уротропина, формальдегида, аммиака.

t⁰ плавления используется для идентификации вещества, установления чистоты..

t⁰ смешанного плавления – берут стандартное и смешанное с ним вещество, если есть температура депрессии, то вещество загрязнено.

t⁰ затвердевания – для веществ, которые находятся в жидком состоянии; эта температура, при которой в течение короткого времени происходит переход ЛВ из жидкого состояния в твердое.

t⁰ кипения – для жидких веществ; температура, при которой жидкость превращается в пар (диапазон температур). Перегонка – интервал между начальной и конечной t⁰ кипения при нормальном атмосферном давлении.

Плотность – измеряется для жидкостей; г/мл. Определяется с помощью пикнометра, ареометра.

Вязкость (внутренне трение) – свойство жидкостей оказывать сопротивление перемещению 1 их части относительно другой при определенной t⁰.