Контрольные вопросы к третьей главе

1. Типы и назначения электродов электрохимической ячейки.

2. Физические основы кондуктометрии.

3. Основные типы и характеристики бесконтактных кондуктометрических преобразователей.

4. Суть потенциометрического метода.

5. Эксплуатационное назначение иономеров.

6. Необходимость температурной компенсации при ионометрии.

7. Принцип работы мембранного электрода.

8. Типы электродов, используемых при вольтамперометрии.

Список литературы, рекомендованной к третьей главе

Андреев В.С. Кондуктометрические методы и приборы в биологии и медицине. М. 1973.

Гусев. В.Г. Методы и технические средства для медико-биологических исследований. Ч. 2. Уфа: УГАТУ. 2001. 119 с.

Дорохова Е.Н., Прохорова Г.В. Аналитические и физико-химические методы анализа. М.: Высшая школа. 1991. 256 с.

Крейцер А.Г. Руководство по эксплуатации медицинских измерительных приборов. Л.: Медицина. 1980. 304 с.

Медицинская электронная аппаратура для здравоохранения. / Под ред. Р.И. Утямышева. М.: Радио и связь. 1981. 344 с.

Попечителев Е.П., Старцева О.Н. Аналитические исследования в медицине, биологии и экологии. М.: Высш. шк. 2003. 279 с.

Техническое обслуживание и ремонт лабораторных приборов, больничного оборудования и систем диагностической визуализации. М.: Медицина. 1995. 183 с.

Электрофизиологическая и фотометрическая медицинская техника. Теория и проектирование. Под ред. Е.П. Попечителева. М. Высш. шк. 2002.

4. Фотометрические методы исследования биологических объектов

4.1. Физические основы и классификация фотометрических методов анализа

Фотометрические методы исследования базируются на способности жидких сред (растворов) поглощать, рассеивать, отражать оптическое излучение и даже излучать электромагнитную энергию под воздействием световой энергии возбуждения или в результате химической реакции (рис. 74).

Взаимодействие лучистой энергии с анализируемым веществом оценивается с помощью следующих методов.

1. Абсорбционный метод анализа заключается в свойстве растворов поглощать видимый свет и электромагнитное излучение в ультрафиолетовом диапазоне. На этом методе основан принцип действия спектрофотометров и фотоколориметров, работающих в диапазоне волн 200-1000 нм.

Каждое вещество поглощает только такое излучение, энергия которого способна вызвать определенные изменения в молекуле этого вещества. В основу абсорбционного метода анализа положен обобщенный закон Бугера-Ламберта-Бера (закона колориметрии), согласно которому, при облучении раствора монохроматическим излучением с длиной волны , поглощение излучения пропорционально концентрации поглощающего вещества в растворе С и толщине поглощающего слоя l

, (25)

где J₀ – интенсивность светового потока, падающего на слой вещества;

J – интенсивность светового потока, прошедшего через слой вещества;

_– коэффициент поглощения, являющийся константой и характеризующий поглощающие свойства вещества при данной длине волны .

Рис. 74. Классификация фотометрических методов лабораторных исследований

Если концентрация раствора С выражена в молях на литр, l – в сантиметрах, то _ называется молярным коэффициентом поглощения. Кроме длины волны он зависит от температуры вещества и не зависит от концентрации растворенного вещества и толщины поглощающего слоя.

Если закон светопоглощения соблюдается, то оптическая плотность раствора D прямо пропорциональна молярному коэффициенту светопоглощения, концентрации вещества и толщине раствора

. (26)

Оптическая плотность и светопропускание связаны между собой зависимостью

, (27)

где – светопропускание.

Оптическая плотность D измеряется в Беллах [Б], значения которой обычно находится в пределах 0-2 Б. Светопропускание Т оценивается в процентах. Значению D = 0Б соответствует 100% светопропусканию, а D = 2Б – светопропусканию в 1 %.

При монохроматическом световом потоке имеет место линейная зависимость между концентрацией вещества и оптической плотностью (рис. 75).

Рис. 75. Зависимость оптической плотности от концентрации раствора

На практике наблюдается нарушение закона Бера вследствие ряда причин:

• поток световой энергии не является строго монохроматичным из-за несовершенства технических средств измерения;

• химическое взаимодействие между молекулами растворителя и частицами вещества, меняющееся при изменении концентрации;

• присутствие посторонних электролитов, влияющих на поглощение световой энергии.

В результате указанных и ряда других причин зависимость на рис. 76 принимает вид кривой. Это следует учитывать при проведении измерений.

Чувствительность и погрешность фотометрического анализа во многом зависит от правильного выбора длины волны, на которой производится измерение, т.е. области спектра, где поглощение данного раствора является максимальным. Для этого проводят измерения оптической плотности раствора или молярного коэффициента светопоглощения при различных динах волн и строят кривые D = f(); _f(), характеризующие светопропускание.

2. Нефелометрический и турбидиметрический анализ. Онпроводится для определения концентрации взвешенных частиц. Оценка производится по показателям поглощения и рассеивания светового потока, падающего на раствор.

Суть метода заключается в том, что интенсивность и направление светового потока, рассеянного взвесью частиц, зависит от размера частиц. Симметричное рассеяние имеет место, когда размер частиц не превышает 0,1 от длины волны (рис. 76 а). Частицы больших размеров рассеивают свет неравномерно.

Когда размер частиц приблизительно равен длине волны светового потока, вперед – по направлению потока рассеивается больше света, чем в обратном направлении (рис. 76 б).

Рис. 76. Рассеяние света при различных соотношениях размера частиц d и длины волны электромагнитного излучения 

Приборы, предназначенные для определения интенсивностей рассеяния взвесей, эмульсий и коллоидных растворов называются нефелометратами и работают в диапазоне длин волн 340-650 нм.

Турбидиметрический метод анализа мутных сред основан на измерении изменения интенсивности потока световой энергии, прошедшей через исследуемый раствор. Изменение потока световой энергии вызвано как поглощением так и его рассеиванием. Турбидиметрические измерения могут быть выполнены практически на любом колориметре или фотометре.

3. Флуориметрический (люминесцентный) анализ основан на измерении вторичного излучения атомов и молекул, возникающего в результате взаимодействия с веществом лучистой энергии. Свечение продолжается практически только в течении времени воздействия возбуждающей энергии и затухает через 10^-8-10^-5 с.

Спектр измерения флюоресценции многих веществ носит дискретный характер. Как и в случае спектров поглощения, дискретность обусловлена структурой и составом излучающего вещества. Спектры излучения растворов состоят из широкой полосы с максимумом при некоторой длине волны. Спектр излучения не зависит от длины волны возбуждающего света.

При построении технических средств и проведении исследований следует учитывать правило Стокса, согласно которому спектр излучения и его максимум по сравнению со спектром поглощения смещен в сторону больших длин волн. Поэтому растворы, облученные световой энергией в УФ диапазоне, могут флуоресцировать любым видимым светом, а растворы, возбуждаемые, например, зеленым светом, не могут светиться фиолетовым и синим, а только желтым и красным, которым соответствует большая длина волны. Для большинства веществ кривые спектров излучения и поглощения частично перекрываются.

Количественное преобразование возбуждающей энергии в энергию флуоресценции называется выходом флуоресценции. Различают квантовый (отношение числа излученных квантов к числу поглощенных) и энергетический (отношение излученной энергии к поглощенной) выходы.

Интенсивность флуоресценции раствора зависит от энергии светового потока Ф_п, поглощенной раствором и квантового выхода. С учетом закона Бугера-Ламберта-Бера она определится по формуле

Ф_Ф = Ф₀  K_  С  l  В_КВ (28)

где Ф₀ – световой поток, поступающий в раствор;

K_ – коэффициент поглощения для данной длины волны, зависящий от растворенного вещества;

С – концентрация вещества в растворе;

l – толщина поглощающего слоя;

В_КВ – квантовый выход флуоресценции.

Учитывая, что при больших разбавлениях раствора и существующих методиках измерений величины Ф₀, K_, l, В_КВ постоянны, интенсивность будет равна

Ф_В = K  С, (29)

где K – коэффициент пропорциональности.

Существуют многочисленные физико-химические факторы отклонения энергии поглощения и энергии флуоресценции от пропорциональности концентрации исследуемого раствора. Поэтому при практическом определении концентрации раствора по световой энергии, требуется предварительное построение градуированных кривых по результатам измерения раствора с известной концентрацией. По сравнению с другими фотометрическими методами флуоресцентный отличается высокой чувствительностью.

Люминесцентный метод применяется также для определения концентрации бактерий и бактериальных взвесей. При этом используются люминесцирующие свойства некоторых красителей (флюорохромов). Для этого их вводят в жидкость или пробу, в которой имеются бактерии. Краситель связывается с клетками бактерий, концентрация которых оценивается, и при облучении УФ излучением кювета с окрашенными бактериями начинает светиться. Интенсивность излучения пропорциональна концентрации бактерий.

Разновидностью люминесцентного является хемилюминесцентный анализ, основанный на регистрации и измерении световой энергии от возбужденных молекул. Такое возбуждение как правило является результатом окислительных реакций в исследуемом веществе. Приборы для хемилюминометрии принципиально не отличаются от флуориметров.

При проведении исследований для возникновения и активизации окислительных процессов в исследуемой пробе используют специальные ферменты – люциферазы.

К хемилюминесцентным методам относят длительные послесвечения проб, которые возникают в результате воздействия на пробу внешним энергетическим излучением, например УФ излучением, в присутствии ферментов. При этом регистрируются и временные изменения интенсивности свечения, имеющие важное диагностическое значение, т.к. характеризуют ход окислительного процесса.

4. Рефлектометрические методы анализа основаны на измерении интенсивности светового потока, отраженного от окрашенной поверхности носителя, которая, в свою очередь, зависит от концентрации исследуемой жидкой пробы. В качестве носителя проб используются специально подготовленные реагентные полоски, выполненные на твердотельной подложке. При контакте такой полоски с биожидкостью цвет ее изменяется. Дальнейшее исследование проводится с помощью рефлектометрических анализаторов, принцип действия которых представлен на рис. 77.

Световой поток от источника световой энергии (1) после прохождения через полосовой фильтр (2), пропускающий излучение в полосе длин волн , падает на носитель реактивов (3) – специальную полоску, пропитанную реактивами. Интенсивность светового потока Ф_отр отраженного от окрашенной поверхности носителя, оценивается с помощью фотоприемника (4). Окраска зависит от концентрации составляющих, содержащихся в жидкой пробе. Эффективность метода зависит от качества реагентных полосок.

В настоящее время используются полоски из чистой целлюлозы, имеющие стандартизованные плотность и толщину и пропитанные реактивами, а так же многослойные аналитические пленки, в которых каждый слой ориентирован на проведение определенного анализа. Верхний слой пленки – распределительный. Он обеспечивает равномерное распределение исследуемой пробы на рабочей поверхности. Следующие слои – реагентная часть, содержащая слои реактивов в сухом виде.

Рис. 77. Направление световых потоков при рефлектометрии: 1 – источник световой энергии; 2 – полосовой фильтр; 3 – твердофазный носитель реактивов; 4 – фотоприемник; Ф₀ – падающий поток световой энергии; Ф_отр – отраженный поток световой энергии;  – полоса пропускания светофильтра

Исследуемая проба дозируется на верхний распределительный слой, равномерно распределяется по нему и за счет капиллярных сил последовательно проходит все реагентные слои системы, образуя цветовой комплекс.