Часть 1. История и общая микробиология.

1. Предмет медицинской микробиологии. Цели, задачи медицинской микробиологии. Практическое значение микробиологических исследований.

Микробиология – наука, изучающая микроскопические существа, названные микроорганизмами, их биологические признаки, систематику, экологию, взаимоотношения с другими организмами, населяющими нашу планету – животными, растениями, человеком.

Предметом изучения частной микробиологии являются организмы и некоторые молекулярные структуры, не видимые невооруженным глазом (меньше 0,1 мм) К частным разделам микробиологии относятся: медицинская, ветеринарная, сельскохозяйственная, техническая (раздел биотехнологии), морская, космическая микробиология.

Предмет изучения медицинской микробиологии: микробы и инфекционные молекулы, взаимодействующие с человеком: – Микроорганизмы, колонизирующие кожу и слизистые человека – Возбудители инфекционных заболеваний человека

Задачи МБ: Изучение структуры и биологических свойств микробов; Изучение взаимоотношений микробов с организмом человека (патогенез), а также их диагностика, профилактика и лечение.

• Диагностика инфекционных заболеваний: Выявление возбудителя (бактерии, вирусы, грибы, простейшие) в крови, моче, мокроте и других материалах. Без этого невозможно назначить правильное лечение.

• Определение чувствительности к антибиотикам (антибиотикограмма): Позволяет выявить, какой антибиотик будет эффективен против конкретного микроорганизма, борясь с устойчивостью (антибиотикорезистентностью).

• Контроль стерильности: В операционных, больничных палатах, при производстве стерильных лекарств (инъекции, капельницы).

• Эпидемиологический надзор: Выявление источников и путей распространения инфекций (вспышки в больницах, пищевые отравления, COVID-19, грипп).

• Разработка и контроль качества вакцин, лекарств.

2. Л. Пастер - основоположник микробиологии как науки. Основные открытия Пастера. Его роль в создании вакцин и развитии иммунологии.

Л.Пастер:

- доказал, что брожение (молочнокислое, спиртовое, уксуснокислое) не явля­ется химическим процессом, а его вызывают микроорганизмы

- установил явление анаэробиоза,

- опроверг теорию самозарождения жизни,  1860 г. он экспериментально доказал, что в стерильном прокипяченном бульоне в открытой колбе размножаются микробы, попавшие из воздуха, но если стерильный бульон будет находиться в колбе, которая сообщается с воздухом через спирально изогнутую стеклянную трубку, то бульон останется стерильным в течение длительного времени, так как бактерии из воздуха будут осаждаться в капельках воды в изогнутой части трубки и не попадут в бульон

- обосновал принципы стерилизации,

- разработал способы получения вакцин и принципы вакцинации(вакцины против сибирской язвы, бешенства)

- указал, что причиной инфекционных болезней человека и животных являются микроорганизмы;

Именно он предложил аттенуацию (ослабление) патогенных свойств микроорганизмов путем длительного культивирования на питательных средах или путем длительного пассирования через организм лабораторных животных.

3. Работы Р. Koxa и их значение в развитии медицинской микробиологии. Методические приемы, разработанные Р.Кохом. Значение работ Р.Коха в изучении туберкулеза.

Генрих Герман Роберт Кох (врач, 1843-1910):

• предложил использовать для микроскопирования бактерий иммерсионную систему и конденсор и микрофотографирование,

• для выращивания микробов – плотные питательные среды на основе желатина и агара;

• разработал методы ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР (ВЧК) микроорганизмов и методы окраски микробов анилиновыми красителями (метилвиолетом и фуксином);

• обосновал использование дезинфектантов при инфекционных заболеваниях;

• разработал метод дробных пересевов;

• выделил постулаты, выражающие роль конкретного микроорганизма в возникновении и развитии инфекционной болезни («найди-докажи-уничтожь»);

• выявил способность сибирской язвы образовывать споры

• выделил возбудителей туберкулеза (1882) и холеры (1883), изучал также возбудителя сибирской язвы;

• создал туберкулин (ныне используется для диагностики туберкулеза).

«триады Генле-Коха». Суть триады заключалась в следующем:

1) предполагаемый микроб-возбудитель всегда должен обнаруживаться только при данном заболевании, не выделяться при других болезнях и от здоровых лиц;

2) микроб-возбудитель должен быть выделен в чистой культуре;

3) чистая культура данного микроба должна вызвать у экспериментальных зараженных животных заболевание с клинической и патологической картиной, аналогичной заболеванию человека.

Практика показала, что все три пункта имеют относительное значение, поскольку далеко не всегда удается выделить возбудителя болезни в чистой культуре и вызвать у подопытных животных заболевание, свойственное человеку. Кроме того, болезнетворные микроорганизмы были найдены у здоровых людей, особенно после перенесенного заболевания.

4. И. И. Мечников и его учение о невосприимчивости к инфекционным болезням (фагоцитарная теория иммунитета). Значение фагоцитоза в защите организма от инфекций.

Илья Ильич Мечников (биолог, 1845-1916), обратил внимание на то, что вводимое в их организм инородное тело всегда окружалось клетками мезодермы, способными его заглатывать.

Процесс поглощения чужеродных элементов этими клетками И. И. Мечников назвал фагоцитозом, а сами клетки – фагоцитами.

В течение 18 лет Мечников работает над теорией фагоцитоза, и в 1882 году наступает его звездный час, он открывает явление фагоцитоза.

Мечников увидел, что лейкоциты человека и неподвижные фагоциты морской звезды эмбриологически гомологичны, т.к. происходят из мезодермы. Отсюда Мечников делает вывод, что лейкоциты выполняют защитную функцию. Болезнь рассматривается как борьба между патогенными микробами и фагоцитами.

В последующем И. И. Мечников и его сотрудники обстоятельно изучили фагоцитарную реакцию у млекопитающих и, наконец, у человека. Так была создана фагоцитарная теория иммунитета, и целебные силы организма впервые были связаны с созданной самой природой для этих целей системой особых клеток – фагоцитов

Макрофагам принадлежит исключительно важная роль в обеспечении защитных реакций. Основные функции, посредством которых они выполняют эту роль, могут быть разделены на четыре типа:

1) хемотаксис;

2) фагоцитоз;

3) секреция БАВ;

4) переработка антигена (процессинг) и представление его с участием белков МНС класса II иммунокомпетентным клеткам, принимающим участие в формировании иммунного ответа (кратко — процессинг и представление АГ).

И.И. Мечников изучал также процессы старения и роль нормальной микрофлоры организма в жизни человека. Поэтому его по праву считают родоначальником геронтологии и учения об эубиозе организма. Совместно с Н.Ф. Гамалеей основал (1886) первую в России бактериологическую станцию.

5. Д. И. Ивановский - основоположник учения о вирусах. Основные постулаты Д.И.Ивановского.

Впервые существование вируса табачной мозаики доказал в 1892 году Дмитрий Иосифович Ивановский (1864-1920, физиолог растений и микробиолог)

Обосновал 3 постулата:

• существуют очень мелкие микробы, которые не видны в обычный микроскоп, фильтруются через бактериальные фильтры;

• это живые микроорганизмы, так как они способны размножаться и сохранять инфекционность;

• эти организмы не растут на искусственных питательных средах.

Д.И. Ивановский открыл вирусы – новую форму существования жизни.

За открытием Ивановского последовали новые открытия вирусов и вирусных заболеваний растений, животных и человека: грипп, ящур, оспа, чума, герпес, и, наконец, открыт вирус СПИДа. Все эти открытия не только укрепили позиции новой области биологии, но и позволили появиться новой самостоятельной науке – вирусологии.

6. Роль отечественных ученых в развитии вирусологии и риккетсиологии, учения об антибиотиках: Л.А. Зильбер, П.Ф. Здродовский, А.В. Пшеничнов, З.В. Ермольева.

Лев Александрович Зильбер (вирусолог, 1894-1966) – его работы по АД-вакцинам и «аллобиофории» вирусов и микроорганизмов. Принцип АД-вакцин был предложен Л. А. Зильбером на основе его ранних работ по термоинактивации антигенов и антисывороток в присутствии антиденатурантов – глицерина или сахарозы. Прогревание бактерии в присутствии антиденатурантов приводило к их инактивации без утраты антигенных свойств, что и было использовано Л. А. Зильбером для приготовления вакцин, которые получили в то время практическое использование.

Павел Феликсович Здродовский (микробиолог, 1890-1976). Разработал план мероприятий по борьбе с малярией в Баку. Исследования по проблемам тропических болезней, бруцеллеза и др. Под руководством Здродовского разработаны методы вакцинации против столбняка, дифтерии и др. инфекций. Автор книги "Учение о риккетсиях и риккетсиозах".

Зинаида Виссарионовна Ермольева (микробиолог, 1898-1974). Занималась изучением холеры, открыла светящийся холероподобный вибрион, носящий её имя. В 1939 году была командирована в Афганистан, где изобрела препарат, эффективность которого во время холерной эпидемии, а также дифтерии и брюшном тифе оказалась так высока, что за создание этого препарата Ермольева получила звание профессора. В 1942 году впервые в СССР получила пенициллин (крустозин ВИЭМ) и активно участвовала в организации его промышленного производства в СССР

Пшеничнов – метод заражения насекомых риккетсиями (метод эпидермомембран), на основе этого метода была разработана вакцина от брюшного тифа

7. История развития микробиологии на Западном Урале (В.М. Здравосмыслов (открытие микробиологической лаборатории, создание бакинститута, организация кафедры микробиологии). Достижения Пермских микробиологов (А.В. Пшеничнов, Б.И. Райхер).

Здравосмыслов Владимир Михайлович (1871-1942) – один из основателей микробиологической службы на Западном Урале.

В 1900 г. в лаборатории было организовано производство противодифтерийной сыворотки, с 1908 г. – скарлатиновой и холерной вакцин, туберкулина, культур мышиного и крысиного тифа.

В.М. Здравосмыслов руководил Пермским бактериологическим институтом, при котором организовал курсы для врачей, медсестер, оспопрививателей, дезинфекторов. С 1916 г. по 1931 г. возглавлял кафедру микробиологии, сначала Пермского государственного университета, а затем медицинского института.

Он занимался разработкой методов микробиологических исследований и производства бактериальных препаратов и антитоксических сывороток.

Пшеничнов Алексей Васильевич (1900-1975) – после окончания в 1925 г. медицинского факультета Пермского университета включился в борьбу с сыпным тифом.

В 1942 г. профессор предложил оригинальный метод заражения кровососущих насекомых – метод эпидермомембран.

В тяжелых условиях войны профессор А.В. Пшеничнов и доцент Б.И. Райхер создали вакцину против сыпного тифа и были удостоены Государственной премии.

Большую научную ценность также представляют исследования А_;В. Пшеничнова и его сотрудников по работе над проблемой клещевого энцефалита на Западном Урале.

Райхер Борис Иосифович (1910-1959) 

В 1943 году они создали вакцину против сыпного тифа, которая была названа вакциной Пшеничнова-Райхера. За этот препарат они были удостоены Государственной премии СССР.

Б.И. Райхер был талантливым организатором противоэпидемических мероприятий,

8. Основы классификации микробов. Понятие о семействе, роде, виде, чистой культуре, штамме. Биологические особенности прокариотов.

В настоящее время в микробиологии приняты два различных подхода к систематике, обусловливающих наличие двух систем классификации: филогенетической (естественной) и фенотипической (искусственной).

В основу филогенетической классификации положена идея создания системы прокариот, объективно отражающей родственные отношения между разными группами бактерий и историю их эволюционного развития.

Фенотипическая классификация преследует, в первую очередь, практические цели, которые заключаются в том, чтобы быстрее установить принадлежность микроорганизма к определенному таксону. 

Надцарство прокариот включает в себя отдел цианобактерий и отдел эубактерий, который, в свою очередь, подразделяется на порядки:

• собственно бактерии (отделы Gracilicutes, Firmicutes, Tenericutes, Mendosicutes);

• актиномицетов;

• спирохет;

• риккетсий;

• хламидий.

Порядки подразделяются на группы, семейства, роды и виды. Основными критериями, позволяющими отнести бактерии к той или иной категории, являются:

• морфология микробных клеток (кокки, палочки, извитые, ветвящиеся);

• отношение к окраске по Граму – тинкториальные свойства (грамположительные и грамотрицательные);

• тип биологического окисления – аэробы, факультативные анаэробы, облигатные анаэробы;

• способность к спорообразованию;

• биохимические свойства;

• антигенная структура.

Вид является эволюционно сложившейся совокупность особей, имеющих единый генотип, который в стандартных условиях проявляется сходными морфологическими, физиологическими, биохимическими признаками. Для патогенных бактерий определение «вид» дополняется способностью вызывать определенные нозологические формы заболеваний. 

Существует внутривидовая дифференцировка бактерий на варианты:

• по биологическим свойствам (биовары или биотипы);

• по биохимической активности (ферментовары);

• по антигенному строению (серовары или серотипы);

• по чувствительности к бактериофагам (фаговары или фаготипы);

• по устойчивости к антибиотикам (резистентовары).

Культура – это видимая глазом совокупность бактерий на питательных средах. Культуры могут быть чистыми (совокупность бактерий одного вида) и смешанными (совокупность бактерий двух или более видов).

Чистая культура – совокупность однородных микроорганизмов, выделенных на питательной среде, характеризующихся сходными морфологическими, тинкториальными, культуральными, биохимическими и антигенными свойствами.

Штамм – это совокупность бактерий одного вида, выделенных из разных источников или из одного источника в разное время.

Клон – это совокупность бактерий, являющихся потомством одной клетки.

Биологические особенности прокариот:

• размеры – до 10 мкм;

• одноклеточные;

• мало органелл, ни у одной нет двойной мембраны;

• система мембран у прокариот представлена только цитоплазматической мембраной, отделяющей цитоплазму от клеточной оболочки;

• не имеют оформленного ядра и ядрышка, имеется нуклеоид (генофор) фибриальной структуры и не отграниченный от цитоплазмы ядерной мембраной, гистонов нет;

• имеют капсулу, клеточную стенку, плазмолемму, цитоплазму, 70S рибосомы, пили, жгутики, нуклеотид, плазмиды, газовые вакуоли;

• в клетках прокариот отсутствуют митохондрии, ЭПР, пластиды у автотрофов, вакуоли, комплекс Гольджи клеточный центр; окислительно-восстановительные ферменты локализованы в мезосомах или ЦП;

• отсутствует митоз, мейоз, они размножаются путем бинарного деления и существуют в гаплоидном состоянии, некоторые способны к спорообразованию;

• для них нетипичны внутриклеточные перемещения цитоплазмы и амебовидное движение.

9. Основные методы изучения морфологии бактерий. Микроскопия и её виды. Простые и сложные методы окраски бактерий (примеры).

Микроскопия:

• Световая – осуществляется с помощью обычного светового микроскопа. Изображение создается за счет различий в степени поглощения света разными участками изучаемого окрашенного объекта. При прохождении луча через окрашенный объект происходит изменение интенсивности света, то есть изменяется амплитуда световой волны.

• Иммерсионная – объектив погружают в каплю имерсионной жидкости. Масло имеет такой же коэффициент преломления, как и стекло, и этим достигается наименьшее рассеивание световых лучей.

• Темнопольная – лучи освещают объект сбоку и не попадают в глаз наблюдателя, поле зрения остается темным, а объект светящимся. В основе темнопольной микроскопии лежит эффект Тиндаля – рассеивание света при прохождении светового пучка через оптически неоднородную среду.

• Фазово-контрастная дает возможность увидеть в микроскоп прозрачные объекты. Они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной.

• Люминесцентная – основана на способности веществ под влиянием падающего на них света испускать лучи с другой длиной волны. При люминесцентной микроскопии используют как естественную (первичную, собственную) люминесценцию микробов, так и искусственную (вторичную, наведенную) люминесценцию.

• Электронная – для ее осуществления необходим электронный микроскоп, принцип его действия заключается в том, что вместо световой волны используется пучок электронов, что позволяет увеличить чувствительность метода на несколько порядков, ЭМ используется для обнаружения и изучения вирусов, а также для изучения ультраструктуры бактериальной клетки.

Простые методы окраски. Проводятся в один этап и заключаются в окраске микропрепарата одним красителем. Используют основные анилиновые красители, такие как, фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий в виде водных растворов или пропитанных красителем фильтровальных бумажек, которые помещают на мазок и смачивают водой. Продолжительность окраски составляет 3-5 минут, после чего микропрепарат промывают водой, высушивают и микроскопируют. В препаратах, окрашенных простым методом, можно получить представление о форме, расположении и размерах микробных клеток.

Сложные методы окраски. Сложные (дифференцирующие) методы окраски (по Граму, Цилю-Нельсону и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и дополнительных способов обработки препаратов. Эти методы позволяют дифференцировать бактерии в зависимости от строения их структур, чаще всего поверхностных. Например, метод окраски по Граму позволяет дифференцировать бактерии по строению их клеточной стенки: грамположительные (фиолетовые) с толстой и грамотрицательные (красные) бактерии с тонкой КС.

Существуют специальные сложные методы окраски, которые используют для выявления структурных компонентов бактериальной клетки: капсул, цитоплазматических включений, спор, жгутиков.

10. Бактериоскопический метод исследования. Цель Примеры использования. Достоинства и недостатки.

Заключается в микроскопическом исследовании неокрашенных образцов (нативный материал) и окрашенных препаратов (мазки или мазки-отпечатки), приготовленных из клинического материала или колоний выросших микроорганизмов с применением различных видов микроскопической техники (световая, темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная, электронная). + просто, доступно, быстро. – трудно определить конкретно какой возбудитель.

Цель

• Быстрое обнаружение бактерий, грибов, простейших или клеточных элементов (например, лейкоцитов) в материале.

• Предварительная идентификация микроорганизмов по морфологическим признакам (форма, размер, расположение) и тинкториальным свойствам (отношение к окраске).

• Оценка характера воспалительного процесса (например, наличие гноя).

Примеры использования

1. Диагностика гонореи — обнаружение грамотрицательных диплококков бобовидной формы внутри лейкоцитов в мазке из уретры или цервикального канала.

2. Выявление туберкулёза — обнаружение кислотоустойчивых палочек (по Цилю-Нильсену) в мокроте.

3. Обнаружение простейших — например, трихомонад в урогенитальных мазках.

11. Морфология и ультраструктура бактерий. Основные (обязательные) и дополнительные структуры бактериальной клетки. Их химический состав и функции.

Морфология

1. Кокки – шаровидные, овальные, бобовидные

1. Микрококки

2. Диплококки

3. Стрептококки

4. Стафилококки

5. Тетракокки

6. Сарцины (в виде пакетов 6-8 особей)

2. Палочковидные

1. Правильной\неправильной формы\ветвящиеся (актиномицеты)

2. Концы – закругленные\обрубленные\заостренные\эллипсоидные\булавовиднын

3. Монобактерии\дипло\стрепто

3. Извитые бактерии

1. Спириллы (4-8 завитков)

2. Спирохеты – тонкие, много завитков

3. Трепонемы – 8-12 мелких завитков

4. Бореллии – длинные, 3-8 завитков разной амплитуды

5. Лептоспиры – мелкие частые завитки, конец загнут

6. Вибрионы – изогнутая палочка

Строение

1. Обязательные структуры

1. Клеточная стенка – основное вещество пептидогликан, у Гр+ пронизан тейхоевыми и липотейхоевыми кислотами, на поверхности АГ и рецепторы, сверху слой белков. У Гр- из внешней мембраны (фосфолипидный бислой) и ПГ без кислот, в мембране белки порины, ЛПС, АГ, эндотоксин. Есть перипоазматическое пространство между ЦПМ и стенкой.

2. Цитоплазматическая мембрана (бислой + белки)

3. Цитоплазма – содержит включения (полисахариды, жиры, фосфаты) и рибосомы

4. Нуклеоид – генетический аппарат, двунитевая кольцевая ДНК

2. Необязательные структуры – капсула, жгутики, пили, плазмиды

12. Особенности строения клеточной стенки бактерий. Её состав, функции. Влияние на тинкториальные свойства микроорганизмов. Методы изучения.

Функции – форма, защита, транспорт, деление, рецепторы

Тейхоевые кислоты дают положительное окрашивание по Граму

• Метод окраски по Цилю-Нильсену — позволяет дифференцировать бактерии на две группы по кислотоустойчивости. Этот метод позволяет выявить туберкулёзную палочку и другие кислотоустойчивые микроорганизмы.

13. Капсулы бактерий. Патогенные бактерии, образующие капсулы (примеры). Их значение. Методы обнаружения капсул.

Капсула или слизистый слой окружает оболочку ряда бактерий. Выделяют микрокапсулу, выявляемую при электронной микроскопии в виде слоя микрофибрилл, и макрокапсулу, обнаруживаемую при световой микроскопии.

Основные свойства капсулы бактерии:

• различима в мазках-отпечатках и при специальных мето­дах окраски;

• гидрофильна;

• предохраняет бактерию от фагоцитоза, бактериофагов, антибиотиков и др. неблагоприятных факторов;

• источник запаса питательных веществ для бактерий;

• препятствует высыханию бактерии.

Основное предназначение капсул – защита бактерий от фагоцитоза.

Капсулы могут быть состоять из полисахаридов (пневмо­кокки) или белков (возбудитель сибирской язвы).

Некоторые бактерии могут образовывать микрокапсулу (выявляется только при электронной микроскопии), например, эшерихии, микобактерии.

Патогенные бактерии, образующие капсулы:

• капсульные бактерии – образуют капсулу постоянно (S. aureus, S. pyogenes, K. pneumoniae, K. rhinosaeromatis и др.),

• капсулообразующие бактерии – образуют капсулу только в организме (S. pneumoniae, B. anthracis, C. perfringens).

Обнаружение капсул по методу Бурри-Гинса (Гинс-Бурри).

Метод Ольта. Используется для выявления капсулы бактерий. Мазок окрашивают 2-3%-ным раствором сафранина. Препарат не высушивают, на нем должна быть вода, накрывают покровным стеклом и рассматривают под иммерсионной системой микроскопа.

тела микробных клеток окрашены в красный цвет, капсулы – в желтый.

Метод Михина. Используется также для выявления капсулы бактерий. Фиксированный мазок окрашивают метиленовым голубым Лёффлера  При микроскопировании тела микробных клеток выглядят темно-синими, капсулы – светло-розовыми.

Окраска капсул методом Кауфмана. Капсулы выглядят темно-красными, бактерии темно-синие.

14. Спорообразование. Патогенные бактерии, образующие споры: бациллы и клостридии (примеры). Биологическое значение спорообразования Методы обнаружения спор.

Споры – специфическим образом устроенные покоящиеся формы бактерий, выдерживающие влияние высокой температуры, радиации, вакуума, различного рода токсических веществ и других неблагоприятных факторов, приводящих к гибели вегетативные клетки.

Спора характеризуется: снижением уровня обмена веществ и высокой устойчивостью к неблагоприятным факторам.

Причины перехода бактерий к спорообразованию: недостаток питательных веществ; недостаток воды; накопление продуктов обмена и др. неблагоприятные условия.

Эндоспоры – это бактериальные споры, которые формируются внутри материнской клетки.

Среди бактерий споры образуют:

• бациллы (диаметр споры не превышает поперечника вегетативной клетки), 

• клостридии (диаметр споры больше поперечника вегетативной клетки – теннисная ракетка).

Известны и спорообразующие кокки.

Расположение спор в клетке бактерии: центрально (в центре), субтерминально (ближе к концу), терминально (на конце клетки).

Строение споры. Центральная часть споры представлена сердцевиной, которая окружена цитоплазматической мембраной (ЦПМ), к которой прилегает зачаточный пептидогликановый слой, затем слой коры – кортекса. На поверхности кортекса есть внешняя мембрана. Снаружи споры окружены многослойной оболочкой.

Cпорообразование (инспоруляция) – это образование споры под контролем комплекса специальных генов.

Стадии спорообразования:

1. Подготовительная – изменяется обмен веществ, завершается удвоение ДНК.

2. Стадия предспоры – со стороны ЦПМ вегетативной клетки происходит врастание двойной мембраны, в результате образуется проспора, окруженная 2-мя мембранами.

3. Образование оболочек – между мембранами образуется зачаточный пептидогликановый слой, затем откладывается слой коры, и вокруг наружной мембраны формируется оболочка.

4. Созревание споры – завершение образования споры (происходит её уплотнение).

5. Разрушение родительской клетки.

6. В оптимальных условиях происходит проростание споры.

Окраска по методу Ожешки.

1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% р-р хлористоводородной к-ты и подогревают на пламени горелки в течение 2-3 минут.

2. Кислоту сливают, препарат промывают водой, просушивают и фиксируют над пламенем горелки.

3. Окрашивают препарат по Цилю-Нельсону.

Споры бактерий преобретают красный цвет, а вегетативные формы – синий.

Окраска по методу Циля-Нельсона.

1. На фиксированный мазок наносят карболовый р-р фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогревают до появления паров 3 раза.

2. На мазок наносят 5% р-р серной к-ты на 5 сек для обесцвечивания.

3. Промывают.

4. Докрашивают мазок метиленовым синим в течение 3 минут

5. Промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Дополнительные методы выявления спор.

Окрашивание спор по методу Златогорова. 

Окрашивание спор по Пешкову.

Окраска спор по методу Виртца в модификации Саватеева.

Окраска спор по методу Виртца в модификации Шеффелера и Фултона.

Окраска спор по Битеру.

15. Жгутики бактерий. Их строение. Классификация бактерий по количеству и расположению жгутиков (примеры). Подвижность бактерий и методы ее изучения. Значение в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний (примеры).

Движение бактерий связано с наличием жгутиков.

Жгутик – видовой признак бактерий, спирально изогнутая полая нить, образованная субъединицами флагеллина 

Бактериальный жгутик имеет толщину 10-20 нм и длину 3-15 мкм, он пассивно вращается расположенным в мембране мотором.

Жгутики бактерий состоят из трёх субструктур.

• Филамент (фибрилла, пропеллер) – полая белковая нить толщиной 10-20 нм и длиной 3-15 мкм, состоящая из флагеллина, субъединицы которого уложены по спирали.

• Крюк — более толстое, чем филамент (20-45 нм), белковое (нефлагеллиновое) образование.

• Базальное тело (трансмембранный мотор).

Расположение жгутиков – характерный признак, имеющий таксономическое значение.

• У некоторых бактерий жгутики расположены по всей поверхности клеточной стенки (например, у бактерий рода Proteus), такие бактерии известны как перитрихи.

• Некоторые бактерии снабжены только одним толстым жгутиком (например, представители рода Vibrio), они известны как монотрихи.

Политрихи — бактерии, имеющие одиночный по виду жгутик, образованный пучком из 2-50 жгутиков. Полярные жгутики прикреплены к одному или обоим концам бактерии.

• Монополярно-политрихиальное расположение жгутиков имеют лофотрихи, к ним, например, относят представителей рода Pseudomonas.

• Биполярно-политрихиальное жгутикование имеют амфитрихи (например, бактерии рода Spirillum).

Выделяют прямые и косвенные методы обнаружения подвижности клеток.

Прямые (выявляют ЖГУТИКИ):

• ЭМ,

• Окраска жгутиков по Лёффлеру:

• Серебрение по Морозову.

Косвенные (выявляют ПОДВИЖНОСТЬ в препаратах):

• препараты «висячей» и «раздавленной» капли (просты в использовании, но могут быть ошибки из-за неправильного приготовления препаратов),

• темнопольная микроскопия,

• посев уколом в полужидкий агар (бактериологический метод, точный, но дорогой).

Значение: является видовым признаком бактерий.

16. Классификация бактерий по типам питания. Ферменты (экзо-и эндоферменты). Методы изучения. Их значение для идентификации бактерий (примеры).

По источнику углерода бактерии делят на:

• автотрофы – источником является СО₂;

• гетеротрофы – источниками являются различные органические соединения

По источнику энергии:

• фотоавтотрофы – это фотосинтезирующие бактерии, использующие энергию солнечного света

• хемоавтоторофы синтезируют органические вещества из СО₂ за счет энергии реакций окисления неорганических соединений

По донору Н₂ (е):

• литотрофы – донором являются неорганические соединения (Н₂О, H₂S);

• органотрофы – донором являются органические

По источнику азота:

• аминоавтотрофы – источником является атмосферный азот, аммонийные соли, нитраты, нитриты;

• аминогетеротрофы – источником являются белки (органические вещества).

По способу усвоения азотистых веществ микробы подразделяются на 4 группы:

• протеолитические – микробы, способные расщеплять нативные белки, пептиды и аминокислоты;

• дезаминирующие – микробы, способные отщеплять аминогруппы только у свободных аминокислот;

• нитритно-нитратные – микробы, усваивающие окисленные формы азота;

• азотфиксирующие микробы, обладающие свойством питаться атмосферным азотом.

Хемо(органо)гетеротрофы для синтеза собственных органических соединений используют энергию окисления других органических веществ, которые являются одновременно и источниками углерода.

К ним относится большинство бактерий:

а) метатрофы – сапрофиты, использующие органические вещества отмерших организмов

б) симбионты, использующие органические вещества других живых организмов, не нанося им вреда

в) паратрофы – паразиты, использующие органические вещества живых организмов, нанося им вред.

Ферменты.

У бактерий различают эндоферменты и экзоферменты.

Эндоферменты находятся внутри бактериальной клетки, катализиру­ют внутриклеточные процессы обмена веществ.

Экзоферменты выделяются во вне­шнюю среду и выполняют функцию расщепления сложных питательных веществ.

Одни ферменты синтезируются бактериальной клеткой постоянно (конститутивные ферменты), другие ферменты синтезируются только при контакте с определенным субстратом (индуцибельные ферменты).

Микроорганизмы синтезируют разнообразные ферменты, которые принадлежат ко всем шести известным классам:

• оксидоредуктазы,

• трансферазы,

• лиазы,

• гидролазы,

• изомеразы

• лигазы.

Значение для идентификации бактерий.

Обязательным условием идентификации выделенной чистой культуры бактерий является определение ферментативной активности в отношении углеводов и белков (биохимический «паспорт» вида).

Сахаролитическая активность бактерий. В состав жидких сред Гисса входит пептонная вода (или МПА – полужидкие), индикатор рН (Андреде или BP), поплавок для улавливания газа и один из углеводов (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит, сахароза, крахмал и т.д.). Если бактерии расщепляют углевод, то образуется кислота и при этом меняется цвет среды за счет находящегося в ней индикатора рН. некоторые виды ферментируют углеводы с образование кислоты и газа (условное обозначение – КГ+) (СО₂). При этом меняется цвет среды и в поплавке появляется пузырек газа.

Протеолитическая активность бактерий. Показателями глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода, разжижение желатина.

Для выявления газообразных веществ делают посевы чистой культуры бактерий на мясо-пептонный бульон или пептонную воду в пробирки со специальными бумажными индикаторами. При наличии продуктов расщепления меняется цвет соответствующего индикатора.

-Индол, сероводород, аммиак

Протеолитическую активность бактерий определяют также путем посева чистой культуры уколом в столбик желатина по наличию и характеру разжижения среды, например, в виде перевернутой елочки, гвоздя, воронки и т.д.

17. Классификация бактерий по типам дыхания. Механизм дыхания бактерий. Практическое значение для диагностики (примеры). Методы культивирования анаэробов.

Дыхание бактерий – это процесс переноса атомов водорода по цепи дыхательных ферментов, в результате которой вырабатывается энергия (АТФ).

Классификация бактерий по типу дыхания - биологического окисления.

По типу дыхания бактерии подразделяются на несколько групп.

• Облигатные (строгие) аэробы растут и размножаются только при свободном доступе кислорода (например, микобактерии туберкулеза);

• Микроаэрофильные бактерии (микроаэрофилы) развиваются при низкой (до 1%) концентрации кислорода в окружающей атмосфере (например, лептоспиры, бруцеллы).

• Факультативные анаэробы развиваются как при доступе кислорода воздуха, так и при его отсутствии (энтеробактерии).

• Облигатные анаэробы растут и размножаются только в бескислородных условиях (возбудитель ботулизма).

• Аэротолерантные микроорганизмы не используют кислород для получения энергии, но могут развиваться в его атмосфере (например, молочнокислые бактерии).

Различное отношение микроорганизмов к кислороду связано с наличием у них различных ферментных систем, в частности, супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы, которые участвуют в нейтрализации токсичных перекисных соединений. Это позволяет их идентифицировать!

Методы культивирования анаэробов.

Механические методы:

1. Посев уколом в столбик сахарного агара (высоким столбом).

2. Метод Виньял-Вейона: в расплавленный и остуженный до 50° С агар вносят исследуемую анаэробную культуру, перемешивают и засасывают в пастеровскую пипетку, конец которой запаивают.

3. Метод Перетца. Исследуемый материал вносят в 3 пробирки с физиологическим раствором, а затем в 3 пробирки с остуженным до 50° С МПА. Содержимое пробирок перемешивают и выливают в 3 стерильные чашки Петри, на дно которых предварительно кладут стерильное предметное стекло, через 18-20 часов инкубации в термостате под пластинками стекла вырастают анаэробы.

Физические методы:

1. Анаэростат – создание вакуумных условий.

2. Аппарат Киппа – замена воздуха индифферентным газом (водородом).

3. Среда Китта-Тароцци – содержит кусочки печени, обладающие высокой адсорбционной способностью, 0,5% глюкозы. Перед посевом среду кипятят на водяной бане не менее 15 минут, сверху заливают слоем вазелиного масла, чтобы предохранить посев от проникновения кислорода.

Химические методы:

1. Прибор Омелянского — для поглощения кислорода используется пирогаллол.

2. Среда Вильсон-Блер. Содержит глюкозу, сернисто-кислый натрий, хлорид железа. Анаэробы образуют черные колонии за счет восстановления сернисто-кислого натрия в сернистый натрий, который, соединяясь с хлоридом железа, образуют осадок черного цвета – сернистое железо.

Биологический метод Фортнера:

Чашку Петри с толстым слоем агара делят на 2 половины на одну половину засевают облигатный аэроб – «чудесную» палочку, на другую половину чашки засевают исследуемую анаэробную культуру. Чашку заливают растопленным парафином. Через 24-48 часов в чашке вырастают аэробы, затем, когда запас кислорода исчерпывается, начинают размножаться анаэробы.

18. Рост и размножение бактерий. Механизм деления. Фазы развития бактериальной популяции. Особенности роста бактерий на жидких и плотных питательных средах (культуральные свойства бактерий).

Рост бактерий – увеличение массы клеток без изменения их числа в популяции как результат скоординирован­ного воспроизведения всех клеточных компонентов и структур. 

Увеличение числа клеток в популяции микроорганизмов обозна­чают термином "размножение". Оно характеризуется временем генерации (интервал времени, за который число клеток удваи­вается) и таким понятием, как концентрация бактерий (число клеток в 1 мл).

В отличие от митотического цикла деления у эукариотов раз­множение большинства прокариотов (бактерий) идет путем бинарного деления, а актиномицетов — почкованием. При этом все прокариоты существуют в гаплоидном состоянии, поскольку молекула ДНК представлена в клетке в единствен­ном числе.

Механизм деления.

Делению клеток предшествует репликация бактериальной хро­мосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается и каждая нить достраивается комплементарной ни­тью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра — нуклеоида. Репликация ДНК происходит в три этапа: инициация, элон­гация, или рост цепи, и терминация.

1. Г+ деление клетки происходит путем образования перегородки, без изменения диаметра клетки. В районе перегородки образуются инвагинации ЦПМ, далее на их основе строится поперечная перегородка из ЦПМ и пептидогликанного слоя.

2. Г- клетки делятся образуя перетяжку. В месте перетяжки диаметр клетки резко сужается. Клеточная стенка и ЦПМ искривляются внутрь и перетягивают клетку пополам. Литические ферменты действуют на перегородку и происходит расхождение клетки.

Фазы развития бактериальной популяции. 

I – исходная стационарная фаза начинается после внесения бактерий в питательную среду.

II – лаг-фаза, или фаза задержки размножения характеризуется началом интенсивного роста клеток, но скорость их деления остается невысокой.

III – лог-фаза, или логарифмическая (экспоненциальная) фаза отличается максимальной скоростью размножения клеток и увеличением численности бактериальной популяции в геометрической прогрессии.

IV – фаза отрицательного ускорения характеризуется меньшей активностью бактериальных клеток и удлинением периода генерации.

V – максимальная стационарная фаза характеризуется равновесием между количеством погибших, вновь образующихся и находящихся в состоянии покоя клеток.

VI – фаза логарифмической гибели бактерий происходит в постоянной скоростью и сменяется VII-VIII фазами уменьшения скорости отмирания клеток.

На ППС – колонии

-величина

-форма

-степень прозрачности

-цвет

-характер поверхности

-положение на ППС (плоская, возвышается и др.)

-характер краев

-структура

Рост бактерий в жидких питательных средах характеризуется следующими признаками. Не встряхивая содержимое пробирки с посевом, вначале обращают внимание на поверхностный рост, который может быть в виде пристеночного кольца или пленки по всей поверхности среды. По своему характеру пленка может быть нежная или грубая, складчатая или ровная; по консистенции – хрупкая, слизистая, сальная.

Отмечают также характер и степень помутнения среды, которое может быть незначительное (в виде опалесценции), слабое, умеренное и интенсивное.

Многие бактерии на жидких питательных средах образуют на дне пробирки осадок, который выявляется при легком встряхивании пробирки. Он может быть незначительным или обильным, зернистым, хлопьевидным, слизистым, крошковидным и т.д.

Ряд бактерий образует водорастворимые пигменты, которые равномерно окрашивают питательную среду в сине-зеленый, ярко-красный и желтый цвета.

19. Культивирование бактерий в условиях лаборатории. Питательные среды, их классификации (примеры). Требования к питательным средам. Основные способы стерилизации питательных сред.