I. Прямые методы

Позволяют непосредственно выявить возбудителя или его компоненты.

1. Микроскопические методы

• Световая микроскопия (нативные и окрашенные препараты):

  • Примеры окраски: по Граму, по Цилю-Нильсену, по Нейссеру.

  • Пример: обнаружение грамположительных кокков в цепочках (стрептококки) в мазке из зева.

• Люминесцентная микроскопия (с использованием флуоресцентных красителей или антител).

• Электронная микроскопия (редко для рутинной диагностики).

2. Бактериологический метод (культуральный)

• Посев материала на питательные среды, выделение чистой культуры и идентификация:

  • По морфологическим, культуральным, биохимическим, серологическим свойствам.

  • Пример: посев крови на гемокультуру при подозрении на сепсис; посев мочи при пиелонефрите.

3. Молекулярно-генетические методы

• ПЦР (полимеразная цепная реакция) и ее варианты (ПЦР в реальном времени, ПЦР-РВ):

  • Выявление специфических фрагментов ДНК/РНК бактерий.

  • Пример: диагностика туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis), коклюша (Bordetella pertussis), ИППП (хламидии, микоплазмы).

• Секвенирование ДНК (определение последовательности нуклеотидов):

  • Для идентификации, определения генов вирулентности, устойчивости к антибиотикам.

4. Иммунологические методы выявления антигенов

• Иммуноферментный анализ (ИФА), иммунохроматографический анализ (экспресс-тесты), реакция коагглютинации, иммунофлуоресценция (РИФ).

  • Пример: определение антигена стрептококка группы А в мазке из зева (экспресс-тест); выявление антигена пневмококка в моче.

II. Косвенные (непрямые) методы

Выявляют иммунный ответ организма на возбудителя (антитела).

1. Серологические методы

• Основаны на выявлении специфических антител в сыворотке крови пациента:

  • Реакция агглютинации (РА, РПГА, РПА).

  • Реакция связывания комплемента (РСК).

  • Иммуноферментный анализ (ИФА) – количественное определение антител классов IgG, IgM, IgA.

  • Реакция иммуноблоттинга (вестерн-блот) – подтверждающий метод.

  • Пример: диагностика брюшного тифа (реакция Видаля – РА), сифилиса (РПГА, ИФА), боррелиоза (ИФА + иммуноблот).

2. Кожные аллергические пробы

• Выявление гиперчувствительности замедленного типа к антигенам возбудителя.

  • Пример: проба Манту с туберкулином для выявления инфицирования микобактериями туберкулеза.

36. Особенности и диагностическая значимость различных методов лабораторной диагностики вирусных инфекций. Примеры.

1. ПРЯМЫЕ МЕТОДЫ (выявление вируса/его компонентов)

А. Цитологические/гистологические методы

Особенности: выявление цитопатического действия вируса в клетках

Значение: быстрый предварительный диагноз, особенно при герпес-вирусах, папилломавирусах

Примеры:

Тельца включений при бешенстве (тельца Негри)

Цитопатические изменения при ЦМВ, ВПГ

Койлоциты при ВПЧ-инфекции

Б. Электронная микроскопия

Особенности: прямое визуальное обнаружение вирусных частиц

В. Выделение вируса в культуре клеток

Особенности: длительно (до 2-3 недель), требуется живая культура клеток

Значение: "золотой стандарт" для многих вирусов, но вытесняется молекулярными методами

Примеры:

Зеленые обезьяньи почки (Vero) для арбовирусов

Культура фибробластов для ЦМВ

Идентификация в культуре: по ЦПЭ, гемадсорбции, иммунофлуоресценции

Г. Обнаружение вирусных антигенов

Методы: ИФА, иммунофлуоресценция (прямая и непрямая РИФ), иммунохроматография

Особенности: быстро (минуты-часы), высокая специфичность

Значение: ранняя диагностика, экспресс-тесты у постели больного

Примеры:

Экспресс-тесты на грипп, РС-вирус из носоглоточных смывов

ИФА на антиген HBsAg (гепатит В)

РИФ для обнаружения вируса бешенства в мозге животных

Д. Молекулярно-генетические методы

ПЦР и ее варианты (ПЦР в реальном времени, ПЦР-РВ):

Особенности: высокая чувствительность и специфичность, быстрота (часы)

Значение: "золотой стандарт" для большинства вирусных инфекций, количественный анализ (вирусная нагрузка)

Примеры:

ВИЧ (определение вирусной нагрузки, мониторинг терапии)

Гепатиты В и С (количественный и генотипирование)

COVID-19 (SARS-CoV-2), герпес-вирусы

2. КОСВЕННЫЕ МЕТОДЫ (выявление иммунного ответа)

А. Серологическая диагностика (антитела)

Методы: ИФА (основной), РИА, РНГА, РТГА, РСК, реакция нейтрализации

Особенности: ретроспективная диагностика, требуется парные сыворотки

Значение: подтверждение диагноза, определение стадии инфекции, оценка иммунитета

37. Состав микробиома различных биотопов человека. Транзиторные и облигатные микроорганизмы. Роль микробов постоянных обитателей организма человека в физиологических процессах.

Роль нормальной микрофлоры

1. Участие во всех видах обмена (ферментация сложных соединений, разрушение ферментов, метаболитов)

2. Детоксикация

3. Синтез витаминов В12, В2, К, РР, В9, Н

4. Защита

5. Колонизационная резистентность (борьба за сайты адгезии и пищевой субстрат, продукция кислот и БАВ)

6. Иммуногенная

7. Усвоение витаминов Д, кальция, железа

Наибольшая обсемененность

1. Толстый кишечник

2. Ротовая полость

3. Мочевыделительная система

4. ВДП

5. Кожа

Состав микрофлоры кишечника

1. Бифидобактерии 9-10

2. Лактобактерии 7-8

3. Бактероиды 9-10

4. Энтерококки 5-8

5. Клостридии не более 5

6. Эшерихии типичные 7-8

7. Эшерихии лактозонегативные не более 5

8. Др. усл. Пат. Не более 4

9. Стафилококки коагулазоотрицательные не более 4

10. Грибы кандида не более 4

11. Неферментирующие грамотрицательные бактерии не более 4

38. Дисбиоз. Определение. Причины возникновения. Клинические проявления. Принципы лабораторной диагностики дисбиоза. Лечебные препараты, применяемые в терапии дисбиоза (пробиотики, пребиотики, метабиотики, синбиотики (примеры)).

Дисбактериоз – стойкие количественные и качественные изменения нормальной микрофлоры

Причины

1. Антибиотткотерапия

2. Нарушение питания

3. Перенесенные заболевания

4. Стресс

5. Химио- и лучевая терапия

6. Лекарственные препараты

Диагностика

Готовят серийные разведения фекалий

1е – плоскирева на патогенные энтеробактерии и на магниевую среду

3е – ЖСА на стафилококки и Сабуро на грибки

5е – кровяной агар на стрептококки, МРС на молочнокислые, стрептококки и лактобактерии, Вильсон-Бэр на клостридии, Эндо\левина на энтерококки

7,9,11е – МРС, Блаурокка на бифидобактерии

Газо-жидкостная хроматография

ПЦР

Лечебные препараты

1. Пробиотики

Определение: Живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах оказывают благоприятное воздействие на здоровье хозяина. Механизм действия:

Конкуренция с патогенами за адгезию и питательные вещества

Синтез бактериоцинов и других ингибирующих веществ

Модуляция иммунного ответа

Восстановление микробного баланса

Акцилакт, Линекс, Аципол, Максилак

2. Пребиотики

Определение: Неперевариваемые компоненты пищи, которые избирательно стимулируют рост и/или активность аутохтонных полезных бактерий. Механизм действия: Служат субстратом для роста аутохтонной микрофлоры (бифидо- и лактобактерий).

Основные группы и примеры:

Олигосахариды: лактулоза (Дюфалак, Нормазе, Лактусан), фруктоолигосахариды (ФОС), галактоолигосахариды (ГОС)

Инулин (содержится в топинамбуре, цикории)

Пищевые волокна: пектин, целлюлоза, отруби

Лактитол (Экспортал)

Препараты: Хилак форте (продукты метаболизма нормальной микрофлоры + пребиотические компоненты)

3. Синбиотики

Определение: Комбинация пробиотиков и пребиотиков, оказывающая синергический эффект. Механизм: Одновременное введение полезных микроорганизмов и субстрата для их роста. Примеры:

Максилак (9 штаммов пробиотиков + олигофруктоза)

Бифистим (бифидобактерии + инулин, пектин, витамины)

Бифиформ Комплекс (3 штамма + инулин)

Нормоспектрум (комплекс пробиотиков + пребиотики + витамины)

4. Метабиотики (постбиотики)

Определение: Продукты метаболизма или структурные компоненты пробиотических микроорганизмов, оказывающие биологически благоприятный эффект. Преимущества: Не содержат живых микроорганизмов, поэтому:

Не зависят от условий хранения

Не инактивируются антибиотиками и желудочным соком

Быстрое начало действия

Безопасны при иммунодефицитах

Компоненты:

Короткоцепочечные жирные кислоты (масляная, пропионовая)

Бактериоцины

Ферменты

Витамины

Пептиды

Тейхоевые кислоты

Примеры препаратов:

Бактистатин (метаболиты Bacillus subtilis + природный сорбент цеолит + гидролизат соевой муки)

Закофальк (кальция бутират + инулин)

39. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Характеристика. Принцип постановки, цели использования.

ПЦР – метод, позволяющий провести многократное увеличение количества определенных молекул ДНК в анализируемом образце

-можно не выделять чистую культуру

-высокая чувствительность

-регулируемая специфичность

Однако легко загрязнить материал – ложноположительные реакции

Компоненты

1. Выделенная ДНК

2. Буферный раствор

3. Ионы магния

4. 2 праймера – одноцепочечные молекулы ДНК

5. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов

6. Термостойкая ДНК-полимераза

Механизм

1. Денатурация – разделение нитей ДНК с помощью температуры 90

2. Отжиг праймеров – их присоединение при температуре 45

3. Элонгация – достраивание молекул ДНК при температуре 72

4. 30-40 циклов

5. Электрофорез в геле для детекции – молекулы ДНК с разной длиной разделяются и становятся видны, детекция с помощью окрашивания, яркость полос говорит о количестве

Цель – диагностика вирусных и бактериальных инфекций

Типы

1. Качественная

2. С обратной транскрипцией – для РНК-содержащих вирусов

3. Количественная (ПЦР в реальном времени) – для оценки эффективности лечения (например ВИЧ), оценки количества условно-патогенных МО во влагалище, кишечнике

4. Мультиплексная – несколько пар праймеров, для диагностики заболеваний с схожей симптоматикой