Работа № 3. Определение активности амилазы (диастазы) в сыворотке крови и моче по методу каравея

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Определение активности амилазы в моче и сыворотке крови используют для диагностики заболеваний поджелудочной железы.

Принцип метода. Метод основан на колориметрическом определении концентрации крахмального субстрата до и после его ферментативного гидролиза. В качестве рабочего раствора используется 0,01 н. раствор йода.

ХОД РАБОТЫ:

Длина волны 630-690 нм (красный светофильтр), кювета с толщиной слоя 1 см.

В 2-х пробирках (опытной и контрольной) проводят анализ согласно таблице:

КОМПОНЕНТЫ	ОПЫТНАЯ ПРОБА	КОНТРОЛЬНАЯ РАБОТА
Раствор стойкого крахмального субстрата	0,5 мл	0,5 мл
прогреть 5 мин в водяном термостате при 370 С
Негемолизированная сыворотка крови	10 мкл	-
прогреть 5 мин в водяном термостате при 370 С
Рабочий раствор йода (0,01 н.)	0,5 мл	0,5 мл
Дистиллированная вода	4 мл	4 мл
Негемолизированная сыворотка крови	-	10 млк
пробирки встряхивают и растворы фотометрируют относительно воды

РАСЧЕТЫ. Расчет активности α-амилазы в г расщепленного крахмала на 1 л сыворотки за 1 час инкубации при 37⁰ С производят по формуле:

Е_к – Е_оп

Х = -------------------- х 240

Е_к

Е_к - экстинкция контрольной пробы;

Е_оп – экстинкция опытной пробы.

НОРМА: Нормальные показатели активности фермента; для сыворотки крови – 16-30 г/час л, мочи – 28-160 г/час л.

РЕЗУЛЬТАТ:

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

Активность α-амилазы в сыворотке крови в норме = 16 – 30 г/час•л, в моче – 28 – 160 г/час•л.

Повышение активности фермента наблюдается при паротите, панкреатите, раке поджелудочной железы, перитоните, циррозе печени, остром инфекционном гепатите, внематочной беременности, диабетическом кетоацидозе.

Снижение активности α-амилазы отмечается при атрофии поджелудочной железы, нарушении фильтрационной функции почек, кахексии.

ВЫВОД:

Дата: _______________

Занятие № 6 работа № 1. Кинетика действия липазы. Влияние желчи на активность липазы

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Липолитические ферменты поджелудочной железы гидролизуют жиры пищи в тонком кишечнике. Желчные кислоты эмульгируют жиры, активируют липазу и участвуют во всасывании продуктов переваривания липидов. Изучая кинетику действия липазы, можно проследить в динамике активность фермента и обозначить факторы, влияющие на этот процесс (температура, концентрация субстрата и продуктов реакции, желчь).

ПРИНЦИП МЕТОДА. Липаза катализирует реакцию:

Липаза

Триацилглицерол------------- глицерол + жирные кислоты

+НОН

О

С Н₂ – О – С

R₁ СН₂ – ОН R₁ – COOH

О липаза │

С Н – О – С -------- СН – ОН + R₂ – COOH

R₂ НОН │

О СН₂ – ОН R₃ – COOH

С Н₂ – О – С

R₃

Скорость действия липазы можно определить по количеству жирных кислот, образующихся за определенный промежуток времени. Количество жирных кислот определяют титрованием щелочью с индикатором фенолфталеином и выражают в мл 0,01 н раствора щелочи.

ХОД РАБОТЫ: взять две большие пробирки: опыт 1 и опыт 2.

ОТМЕРИТЬ	ОПЫТ-1 (без желчи)	ОПЫТ-2 (с желчью)
Молоко (1:10) Н2О Раствор желчи Липаза из поджелудочной железы	10,0 мл 1,0 мл - 1,0 мл	10,0 мл - 1,0 мл 1,0 мл
	Перемешать и поместить в термостат при 38оС. Взять по 2 мл в колбочки + 1-2 капли фенолфталеина, титровать 0,01 н NaOH до розовой окраски.

При первом титровании нейтрализуют кислоты, присутствующие в молоке до начала действия липазы.

Результаты первого титрования (до начала действия липазы) вычитают из результатов последующих титрований, которые проводят через 15, 30 и 45 минут.

Время инкубации, мин.	Объем 0,01 н раствора NaOH, пошедшего на титрование
Результат 0 определения: 15 30 45	Х Y – X =  Y Z – X =  Z E – X =  E	Без желчи	С желчью

РЕЗУЛЬТАТ: данные титрования записать в таблицу.

КОНЕЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ: полученные данные используют для построения графика.

К инетика действия липазы:

V_мл NaOH

0 ,01 н

время (мин)

15 30 45

ВЫВОД:

Дата_________________

ЗАНЯТИЕ № 7

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ АУДИТОРНАЯ РАБОТА

ПО ТЕМЕ «БЕЛКИ, ФЕРМЕНТЫ»

Дата: _______________

ЗАНЯТИЕ № 9

РАБОТА № 1. ГИДРОЛИЗ НУКЛЕОПРОТЕИДОВ ДРОЖЖЕЙ

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Кислотный гидролиз используется для изучения химического состава нуклеопротеидов.

ПРИНЦИП МЕТОДА:

СХЕМА ГИДРОЛИЗА НУКЛЕОПРОТЕИДОВ

НУКЛЕОПРОТЕИДЫ (дрожжи)

H₂SO₄ 10%

100^oC

БЕЛОК НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

(протамины или гистоны) (ДНК, РНК)

ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ

ПОЛИПЕПТИДЫ ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ

ТРИ-, ДИПЕПТИДЫ

СВОБОДНЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ МОНОНУКЛЕОТИДЫ

НУКЛЕОЗИДЫ ФОСФОРНАЯ

КИСЛОТА

ПУРИНОВЫЕ ДЕЗОКСИРИБОЗА

ИЛИ ПИРИМИДИНОВЫЕ ИЛИ РИБОЗА

АЗОТИСТЫЕ ОСНОВАНИЯ

Продукты гидролиза открывают специфическими реакциями: полипептиды – биуретовой реакцией; пуриновые основания – серебряной пробой (серебряные соли пуринов образуют светло-коричневый осадок), пентозы – пробой Троммера (возникает красное окрашивание вследствие окисления рибозы), фосфорную кислоту – молибденовой пробой (образуется фосфорномолибденовокислый аммоний – желтый кристаллический осадок).

ХОД РАБОТЫ: взять колбу, внести 5 г дрожжей + 40 мл 10%-го раствора H₂SO₄, закрыть пробкой со стеклянной трубкой и поставить для кипения (100^оС) на 60 минут.

Через час охладить и отфильтровать.

В фильтрате открыть продукты гидролиза.

Взять четыре пробирки и в каждой выполнить реакцию:

	ОТМЕРИТЬ	ОПЫТ
БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ	Гидролизат NaOH 10% CuSO4 1 %	5 капель 10 капель 1 - 2 капли
Возникает фиолетовое окрашивание
СЕРЕБРЯНАЯ ПРОБА НА ПУРИНЫ	Гидролизат (NH4)OH конц. AgNO3 1 %	10 капель 1 каплю 5 капель
Оставить на 5 мин.		Образуется светло-коричневый осадок.
3. ПРОБА ТРОММЕРА НА РИБОЗУ И ДЕЗОКСИРИБОЗУ	Гидролизат NaOH 30 % CuSO4 7 %	5 капель 10 капель 3 капли
Нагреть до начала кипения. Выпадает красный осадок Cu2O или желтый CuOH
4. МОЛИБДЕНОВАЯ ПРОБА НА ФОСФОРНУЮ КИСЛОТУ	Молибденовый реактив Гидролизат	20 капель 5 капель
	Кипятить несколько минут, получается окраска лимонно-желтого цвета.

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

Дата: _______________