Занятие № 10 работа № 1. Количественное определение мочевой кислоты в моче

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Мочевая кислота образуется из пуриновых оснований (аденин, гуанин). Выделение мочевой кислоты с мочой зависит от содержания пуринов в пище и от состояния обмена нуклеиновых кислот в организме. Мочевая кислота в виде кислого урата натрия входит в состав подагрических отложений в сухожилиях, хрящах, слизистых оболочках суставных сумок. Метаболит существует в виде 2-х таутомерных форм.

ПРИНЦИП МЕТОДА. Мочевая кислота окисляется кислородом при каталитическом действии фермента уриказы с образованием перекиси водорода и аллантоина. Образующаяся перекись водорода под действием перексидазы окисляет субстрат с образованием окрашенного продукта, определяемого фотометрически.

ХОД РАБОТЫ: взять две пробирки.

Отмерить	Стандарт	Опыт
Сыворотка крови или разведенная моча	-	0,0025
Калибровочный раствор 375 мкмоль/л	0,025	-
Рабочий реагент	1	1

Реакционную смесь перемешивают и инкубируют 10 мин при температуре 37^оС. Длина волны 500-520 нм (490 нм, ФЭК), кювета 0,5 см. Измеряют оптическую плотность опытной пробы против воды. Стабильность окраски 15 минут.

ВЫЧИСЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТА:

С_пр = С_ст х А_пр/А_ст (мкмоль/л)

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

У взрослых здоровых людей с мочой за сутки выделяется 1,5 – 4,5 ммоль в сутки мочевой кислоты. В сыворотке крови женщины – 140-340 мкмоль/л, мужчины – 200-415 мкмоль/л.

Повышенная экскреция мочевой кислоты (гиперурикурия) наблюдается при заболеваниях, сопровождающихся ускоренной гибелью клеток (терапия раковых и лейкозных больных цитостатиками, гемобластозы, гемолитические процессы, псориаз, синдром длительного сдавления), токсикозах беременности, алкоголизации, потреблении богатых пуринами продуктов (печень, почки, икра рыб).

Пониженное выведение мочевой кислоты (гипоурикурия) отмечается при почечной недостаточности, подагре, нефритах, отравлениях свинцом и бериллием, синдроме Дауна.

Дата_______________

Занятие № 11 самостоятельная аудиторная работа

ПО ТЕМЕ «БИОСИНТЕЗ БЕЛКОВ»

Задания для самостоятельной работы:

1. Написать реакции образования и строение валил-тРНК.

2. Составить схему биосинтеза дипептида метионилглутамата (стадии инициации и элонгации трансляции).

3. Рассмотреть роль генной инженерии в получении белков человека. Записать схему процесса.

4. Рассмотреть роль полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике. Записать схему ПЦР.

5. Выполнить индивидуальные задания по теме.

Дата: _______________

Занятие № 12 работа № 1. Определение активности сукцинатдегидрогеназы

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. СДГ один из ключевых ферментов цикла трикарбоновых кислот, прочно связанный с внутренней мембраной митохондрий. Роль кофермента выполняет ФАД, соединенный с белком ковалентной связью. Фермент in vivo окисляет янтарную кислоту (сукцинат):

ФАД ФАДН₂

СООН СООН

СН2 СН

СН2 сукцинатдегидрогеназа СН

(СДГ)

СООН СООН

Сукцинат Фумарат

Работа дает представление о дегидрогеназных реакциях в ЦТК.

ПРИНЦИП МЕТОДА.

Субстрат – янтарная кислота. Конечный акцептор водорода – 2,6-дихлорфенолиндофенол (синий цвет), который при восстановлении превращается в бесцветную лейкоформу. Источником фермента является отмытая мышечная ткань. В опыте (in vitro) ход реакций следующий:

Малонат является конкурентным ингибитором фермента СДГ.

ХОД РАБОТЫ:

А. Получение ферментного препарата.

2 г свежих мышц измельчают ножницами, гомогенизируют с небольшим количеством воды. Мышечную кашицу переносят на двойной слой марли (воронка) и промывают 25 мл воды. Отжатую мышечную массу переносят в пробирку, добавляют 4 мл воды, размешивают стеклянной палочкой и суспензию равномерно разливают в 4 пробирки.

Б. Определение активности фермента.

Взять четыре пробирки и приготовить инкубационные смеси в соответствии со схемой:

№ пробирки отмерить	1	2	3	4
Ферментный препарат (гомогенат ткани) Н2О Малонат Сукцинат 2,6-дихлорфенолиндофенол	1,0 мл кипячение 2 минуты 0,5 мл - 1,0 мл 2 капли	1,0 мл - 0,5 мл - 1,0 мл 2 капли	1,0 мл - 1,5 мл - - 2 капли	1,0 мл - - 0,5 мл 1,0 мл 2 капли
Перемешать. Инкубация 15 минут при 37о С. в термостате

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД: