Работа № 2. Определение активности цитохромоксидазы

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Цитохромоксидаза является хромопротеином, содержит геминовую группу и Cu²⁺, активна в растительных и животных тканях, осуществляет перенос электронов на кислород в цепи тканевого дыхания. Определение активности фермента дает представление о функционировании цепи переноса электронов.

Принцип метода. Смесь -нафтола и п-фенилендиамина (реактив «Нади») окисляется цитохромоксидазой в присутствии кислорода, образуя продукт конденсации индофеноловый синий по схеме:

ХОД РАБОТЫ:

А. Получение ферментного препарата.

0,5 г свежих мышц растирают в ступке с 10 мл Н₂О. Воду сливают, мышечную ткань просушивают фильтровальной бумагой.

Б. Определение активности фермента.

Мышечную ткань разделяют на 2 части. Одну помещают на фильтр, другую переносят в пробирку, добавляют 1 мл Н₂О и кипятят 1 минуту. После охлаждения извлекают прокипяченную мышечную ткань стеклянной палочкой и помещают на фильтр.

На обе порции мышц наносят по 2 капли реактива «Нади» (смесь п-фенилендиамина и -нафтола). Инкубация 5-10 минут, при температуре 18^оС (комнатная).

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

Дата: _______________

Занятие № 13 работа № 1. Количественное определение макроэргических соединений мышц

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Главный макроэрг клеток человека и животных – АТФ – образуется в реакциях окислительного и субстратного фосфорилирования АДФ. В мышцах содержится креатинфосфат – макроэрг, образующийся с участием АТФ. Оба вещества обеспечивают энергией мышцы при их сокращении.

ПРИНЦИП МЕТОДА. Богатые энергией два остатка фосфорной кислоты АТФ и фосфорный остаток креатинфосфата быстро отщепляются при гидролизе в кислой среде (лабильно связанный фосфор). Сравнение содержания неорганического фосфора, определяемого по цветной реакции с молибдатом аммония и аскорбиновой кислотой до и после гидролиза, указывает на количество лабильно связанного фосфора макроэргов, что отражает количество макроэргических соединений в мышцах.

ХОД РАБОТЫ:

А. Выделение макроэргов из мышц.

0,5 г мышцы гомогенизируют в 5 мл охлажденной 2,5 % ТХУ во льду. Фильтруют в мерную пробирку, осадок на фильтре промывают 5 мл холодной Н₂О. Объем доводят до 10 мл.

Б. Определение лабильно связанного фосфора.

Взять две пробирки: контроль и опыт.

ОТМЕРИТЬ	КОНТРОЛЬ	ОПЫТ
Безбелковый фильтрат НСl, 1 М NaOH, 1 M H2O Молибдат аммония, 1 % Аскорбиновая кислота, 1 %	0,5 мл 1 мл 1 мл 2,5 мл 0,5 мл 0,5 мл	0,5 мл 1 мл Кипятить 10 минут, охладить 1 мл 2,5 мл 0,5 мл 0,5 мл
	 Перемешать, инкубация 10 минут, при 18оС.  Колориметрия, λ = 640 нм, d = 1 cм, против контроля

РЕЗУЛЬТАТ:

Ех =

Расчеты:

зная Ех, найти концентрацию фосфора в пробе по калибровочному графику (А). Конечный результат рассчитать по формуле:

содержание макроэргов в мг АТФ/ г ткани = А  3,3  40.

Найти количество АТФ в 1 г мышечной ткани:

количество АТФ = масса АТФ (в граммах)/молекулярная масса АТФ

ВЫВОД:

Содержание АТФ в мышцах:  5 мкмоль АТФ в 1 г мышечной ткани в состоянии покоя (молекулярная масса АТФ равна 507,2 г/моль).

Дата________________

ЗАНЯТИЕ № 14

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ АУДИТОРНАЯ РАБОТА

ПО ТЕМЕ «ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН. РОЛЬ КИСЛОРОДА В ПРОЦЕССАХ ОКИСЛЕНИЯ В КЛЕТКЕ»

Задания для самостоятельной работы:

1. Изобразить общую схему энергетического обмена.

2. Показать взаимосвязь ЦТК и ЦТД.

3. Указать витаминзависимые ферменты ЦТК.

4. Показать анаболические функции ЦТК.

5. Отметить регуляцию ЦТК.

6. Решение ситуационных задач.

Дата: _______________

ЗАНЯТИЕ № 16

РАБОТА № 1. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА АДРЕНАЛИН

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. В мозговом слое надпочечников синтезируются катехоламины из аминокислоты тирозина. Адреналин и норадреналин способствуют распаду гликогена, стимулируют фосфорилазную активность в печени, мышцах, надпочечниках.

ПРИНЦИП МЕТОДА. В молекулу адреналина и норадреналина входит пирокатехиновое кольцо. При его взаимодействии с хлорным железом наблюдается зеленое окрашивание. При добавлении NaOH – вишнево-красное окрашивание.

ХОД РАБОТЫ: взять две пробирки: контроль и опыт.

ОТМЕРИТЬ	КОНТРОЛЬ	ОПЫТ
Н2О дист. Раствор адреналина FeCl3	10 капель - 1 капля	- 10 капель 1 капля
	Окрашивание слабо-желтое за счет FeCl3	Наблюдается зеленое окрашивание
NaOH , 10 %	3 капли	3 капли
	Окраска не изменилась	Наблюдается вишнево-красное окрашивание.

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

Нормальное содержание адреналина в крови – до 6,28 нмоль/л, в моче 27,3 – 81,9 нмоль/сут.

Увеличение экскреции адреналина отмечается при феохромоцитоме, гипертонической болезни (в период кризов), в острый период инфаркта миокарда, гепатитах и циррозах печени, обострении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, а также под влиянием курения, физической нагрузки и эмоционального стресса.

Экскреция адреналина с мочой снижена при аддисоновой болезни, коллагенозах, острых лейкозах, остро протекающих инфекционных заболеваниях.

Дата: _______________

ЗАНЯТИЕ № 17

РАБОТА № 1.

Дата: ________________

ЗАНЯТИЕ № 18

РАБОТА № 1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА С

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Витамин С участвует в окислительно-восстановительных процессах; в синтезе стероидных гормонов и катехоламинов в надпочечниках; как кофактор ферментов гидроксилаз (катализирующих превращение пролина в оксипролин); ускоряет всасывание железа, активирует пепсиноген. Недостаток витамина С в организме приводит к нарушению этих процессов.

ПРИНЦИП МЕТОДА. Метод основан на восстановлении витамином С 2,6-дихлорфенолиндофенола (2,6-ДХФИФ), который в кислой среде имеет красную окраску, в щелочной среде синюю, а при восстановлении обесцвечивается. Исследуемый раствор титруют в кислой среде щелочным раствором 2,6-ДХФИФ до розовой окраски.

ХОД РАБОТЫ: взять колбочку.

ОТМЕРИТЬ	О П Ы Т
М о ч а	10,0 мл
Н2О дист.	10,0 мл
HCl 10 %	20 капель
2,6 ДХФИФ 0,001 н	Титровать до розовой окраски

РЕЗУЛЬТАТ:

КОНЕЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ рассчитывают по формуле:

0,088А1500

Х = ------------------- = мг/сутки

10

0,088 - содержание аскорбиновой кислоты, мг

А - результат титрования

1500. - среднее суточное количество мочи, мл

10 - объем мочи, взятый для титрования, мл

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

Нормальное содержание витамина С в крови составляет 34-114 мкмоль/л. Норма экскреции витамина с мочой = 20-30 мг/сут.

Содержание витамина С в моче дает сведения о запасах витамина в организме, о соответствии между его содержанием в крови и экскрецией из организма. При приеме 100 мг витамина С в случае его дефицита в организме его концентрация в моче не повышается. Уровень аскорбата в моче снижается при острых и хронических инфекционных заболеваниях, анемии, стеаторее, нарушении всасывания, алкоголизме.

ВЫВОД:

Дата: ________________