5. Ферменты

Вещества белковой природы, катализирующие химические превраще-ния в живых клетках, называют ферментами или энзимами. Здесь не просто лингвистическое расхождение. На начальном этапе развития био-химии в 50-е годы XIX века шёл спор между Пастером с одной стороны и Бертло и Либихом с другой. Пастер был убежден в том, что процесс бро-жения неотделим от дрожжевых клеток и осуществляющие это превраще-ние катализаторы – организованные ферменты (от лат. fermentum – закваска) – от клеток неотделимы. Бертло и Либих оперировали понятием энзим (от греч. en – в, zyme – закваска, т.е. то, что в закваске), относя его к секретируемым клетками катализаторам пищеварительных процессов: пепсину, трипсину, амилазе и др. Позиция Пастера основывалась на том, что он проводил стерилизацию клеточных культур нагреванием, при кото-ром шла и денатурация ферментов, а Бертло и Либих работали с фермен-тами из пищеварительных соков, не проводя их термическую обработку. В соответствии с этим биокатализаторы вне продуцирующей их клетки принято называть энзимами. Это означает, что биокатализаторы в составе стирального порошка, в названии которого есть приставка «био», или в таблетке фестала можно называть энзимами, в то же время в биохимии, рассматривающей обменные процессы в клетках, говорят обычно о ферментах, хотя относящийся к ферментам раздел биохимии называют энзимологией для того, чтобы понятие было составлено из слов только одного языка (в данном случае греческого).

Работу ферментов выбрал для иллюстрации особенности биохимичес-ких процессов известный биохимик Сент-Дьёрдь. Во введении к своей книге по биохимии он напомнил, что в гробнице Тутанхамона несколько тысяч лет пролежала высохшая трапеза фараона, оставленная ему для загробной жизни. Будучи съеденной, она превратилась бы в диоксид угле-рода, воду и другие продукты метаболизма в считанные часы.

Надо сказать, что начало биохимии в нашем сегодняшнем понимании было положено работами Э.Бухнера (1898 г.), показавшего, что после дли-тельного перемешивания дрожжевых клеток с инфузорной землёй проис-ходит их разрушение, но полученный бесклеточный сок некоторое время сохраняет способность к сбраживанию глюкозы. На самом деле аналогич-ные опыты ставились намного раньше, например, за 25 лет до публикации Бухнера появилась статья на эту тему Манасеиной (Коркуновой) на рус-ском и немецком языках; были и более ранние сообщения.

Что же отличает ферменты, как катализаторы? В общем можно выделить три особенности этих катализаторов:

1. Высокая эффективность. Под этим подразумевается, что реакции, ко-торые в обычных условиях идут очень медленно или вообще не идут, в присутствии ферментов протекают с очень высокой скоростью. Правда, скорость при этом понятие относительное. Если одна молекула пепсина вызывает расщепление примерно десяти пептидных связей в секунду, то молекула каталазы, разлагающая пероксид водорода на воду и кислород, осуществляет десятки тысяч превращений в секунду.

2. Ферменты высокоспецифичны по типу реакций, т.е. каждый фермент катализирует только одну реакцию, например, глютаминовая кислота в присутствии соответствующей декарбоксилазы превращается в -ами-номасляную кислоту, а в присутствии фермента, относящегося к транс-аминазам, из неё образуется кетоглутаровая кислота.

3. Ферменты чаще всего специфичны, избирательны по субстрату. На-пример, превращение гидроксильной группы в карбонильную осущест-вляют ферменты, относящиеся к дегидрогеназам, но этанол превраща-ется в ацетальдегид алкогольдегидрогеназой, а молочная кислота в пировиноградную – лактатдегидрогеназой. Хотя, конечно, есть и фер-менты с невысокой избирательностью, например, пищеварительные.

Из этого следует, что ферментов, осуществляющих всё многообразие метаболических превращений, должно быть очень много. В 1930 г. было известно всего лишь 80 ферментов, а в 1994 г. около 3200. Долгое время безуспешно искали ферменты не только среди белков, но и среди других классов биополимеров и лишь в последние годы было показано, что пре-вращения определённых субстратов могут катализировать и некоторые рибонуклеиновые кислоты, названные рибозимами.

Ферменты, выделенные и охарактеризованные на ранней стадии раз-вития биохимии, получали имена собственные (трипсин, пепсин, тром-бин), затем названия ферментов стали образовывать по названию субстра-тов с окончанием -аза (аргинин  аргиназа, аспарагин  аспарагиназа, мочевина  уреаза и т.д.). Сейчас название субстрата чаще всего допол-няют типом осуществляемого ферментом химического превращения (лактатдегидрогеназа, холинэстераза, супероксиддисмутаза). Обилие таких названий может напугать приступающего к изучению биохимии, но этот испуг легко преодолим, так как, в конце концов, даже специалисты имеют обычно дело с ограниченным числом биохимических превращений. Если выделять из биохимии раздел энзимологии, то такая путаница в названиях становится слишком обременительной, и поэтому была принята цифровая классификация ферментов, включающая четыре группы цифр: класс, под-класс, подподкласс и номер фермента в подподклассе. Исторически выде-лилось шесть классов ферментов.

Первый класс представляют оксидоредуктазы. В их число входят, например, дегидрогеназы, т.е. ферменты, катализирующие дегидрирова-ние спиртовых групп до карбонильных групп, окисление карбонильных групп до карбоксильных, дегидрирование с образованием этиленовых соединений, дегидрирование групп СН-NН₂, приводящее к образованию иминов (C=NH), и т.д. Реакции дегидрирования протекают по схеме:

Чаще всего в роли акцепторов водорода выступают небелковые моле-кулы (коферменты), входящие в состав дегидрогеназ. Если атомы водо-рода или электроны непосредственно переносятся на кислород, то такие ферменты относятся к подклассу оксигеназ.

Второй класс представляют трансферазы – это ферменты, катали-зирующие перенос многоатомных групп с одной молекулы на другую. В их число входят, например, ферменты, переносящие фосфатные остатки с аденозинтрифосфата на молекулы сахаров (фосфофруктокиназа), фермен-ты, переносящие одноуглеродные фрагменты (фолатзависимые фермен-ты). К трансферазам относятся также трансаминазы, обменивающие аминогруппы на карбонильные функциональные группы.

Ферменты третьего класса – это гидролазы. Они катализируют пере-нос двух фрагментов расщепляемой молекулы на молекулу воды, т.е. реакцию гидролиза. Если они гидролизуют пептидные связи в белках, то это протеазы или пептидазы. Отщепление С‑концевой аминокислоты ката-лизируют карбопептидазы, а N-концевой – аминопептидазы. Гидролити-ческое расщепление нуклеиновых кислот идёт в присутствии нуклеаз (ДНК-аза, РНК-аза).

Четвёртый класс ферментов – это лиазы. Они катализируют расщеп-ление субстрата с образованием кратной связи или в обратном направ-лении – присоединение по кратной связи (в этом варианте обратной реак-ции их называют обычно синтазами). В качестве примера можно привести карбоангидразу, катализирующую реакцию образования бикарбоната из диоксида углерода и воды:

К пятому классу относятся изомеразы. Уже их название характери-зует тип катализируемых этими ферментами превращений. Можно только добавить, что наряду с простой изомеризацией, связанной, например, с переносом ацильной (фосфорильной) группы с одной гидроксильной груп-пы на другую, изомеразы катализируют и более сложные реакции. Напри-мер, к ним относятся рацемазы и эпимеразы (если речь идёт об образова-нии другого диастереоизомера), а кобаламинзависимые изомеразы по радикальному механизму катализируют и перестройку углеродного ске-лета молекул. С их участием, например, метилмалоновая кислота в виде её тиоэфира с коферментом А превращается в сукцинил-кофермент А:

Шестой класс ферментов – это лигазы (синтетазы). Главная особен-ность этих ферментов состоит в том, что энергию, требуемую для про-текания катализируемых ими превращений, поставляют так называемые макроэргические вещества, главным из которых является АТФ. Примером катализируемых лигазами реакций служит образование C-N-, C-S- и С-С-связей (например, пептидных связей, тиоэфиров и т.д.).

Набор функциональных групп в белковых аминокислотах невелик, и с их помощью белковая молекула не может обеспечить катализ всех тре-буемых для протекания метаболических процессов реакций. Вследствие этого во многих случаях к работе ферментов подключаются вещества небелковой природы, которые могут быть связаны с белковой молекулой ковалентными связями, солевыми связями или же они могут образовывать более или менее прочные комплексы с белковой частью фермента, кото-рую называют апоферментом. Если небелковая составляющая фермента связана с белком ковалентной связью, то её называют простетической группой, а связанную с апоферментом водородными связями, солевыми, Ван-дер-Ваальсовыми или гидрофобными взаимодействиями небелковую компоненту называют коферментом (в последнее время входит в употреб-ление термин косубстрат, т.е. дополнительный, вспомогательный суб-страт). Обладающий каталитической активностью комплекс кофермента и апофермента, если это надо подчеркнуть, называют холоферментом. Коферменты или простетические группы отвечают за химизм катализируе-мого превращения. Образование холофермента стабилизирует апофермент, поскольку при этом реализуется наиболее выгодная в энергетическом отношении структура, поэтому апофермент легче денатурируется, чем холофермент. Но белковая компонента не только определяет специфич-ность фермента по субстрату, обеспечивает связывание с субстратом и отход от каталитического центра продуктов реакции. В отдельных случаях, как отмечалось выше, она определяет и химизм катализируемой реакции. Кроме коферментов или простетических групп в состав ферментов могут входить и кофакторы – чаще всего это ионы металлов, известные нам как микроэлементы.

Существуют также ферменты, каталитический центр которых состав-лен только функциональными группами аминокислот, но и они чаще всего наиболее активны при наличии в их структуре кофакторов. Так, например, в каталитическом центре сериновых гидролаз находится ион цинка.

Особую роль в метаболических процессах играют аллостерические ферменты, молекулы которых, кроме каталитических центров, имеют ещё и регуляторные участки. В результате связывания с ними веществ, назы-ваемых эффекторами, активность фермента может возрастать (положи-тельный эффектор) или снижаться (отрицательный). Аллостерические ферменты отличаются более сложным строением и более высокой моле-кулярной массой.

Строение многих коферментов и простетических групп было установ-лено ещё в 30-е годы прошлого века. Оказалось, что чаще всего они обра-зуются в результате более или менее сложных биохимических превраще-ний витаминов. Так, например, витамин В₁ (или тиамин), входит в состав лиаз, декарбоксилирующих -кетокислоты (пируватдекарбоксилаза, пиру-ватдегидрогеназа, кетоглутаратдегидрогеназа), в виде эфира с пирофос-форной кислотой – тиаминпирофосфата (ТПП):

Кофермент пиридоксальфосфат, принимающий участие в реакциях переаминирования (трансаминазы) и декарбоксилирования аминокислот (лиазы), образуется в результате монофосфорилирования витамина В₆ – пиридоксаля:

Более сложная цепочка превращений идёт от никотинамида (вита-мина В₃) к коферменту реакций гидрирования-дегидрирования – никотин-амидадениндинуклеотиду NAD⁺ (никотинамид и никотиновую кислоту сейчас принято назвать ниацином):

и

Ещё одна группа ферментов, принимающих участие в реакциях гид-рирования-дегидрирования, представлена флавопротеинами (FMN и FAD, флавинмононуклеотид и флавинадениндинуклеотид), у которых донором-акцептором атомов водорода является рибофлавиновый структурный эле-мент, поступающий в организм в виде витамина В₂:

Важную роль в окислительно-восстановительных превращениях в биологических системах играют цитохромы (цито – от греч. kytos – вме-щающее, клетка; хрома – цвет, окрашивание). В их состав входят железо-порфирины, которые представлены макроциклами из четырёх связанных метиновыми мостиками пиррольных колец с атомом железа в центре.

В качестве примера приведена структура гема – железопорфирина, входящего в состав гемоглобина и предназначенного для переноса молеку-лярного кислорода. Гем соединён с белковыми молекулами тиоэфирными связями, образовавшимися в результате присоединения сульфгидрильных групп из остатков цистеина по винильным группам гема.

Содержащие гемовые структуры цитохромы оксидоредуктаз, окра-шенные в цвета от красного до коричневого, участвуют в переносе элект-ронов (Fe⁺²  Fe⁺³ + e), например, когда образовавшиеся в реакциях дегидрирования атомы водорода отдают соответствующим акцепторам свои электроны и превращаются в протоны. Цитохромы обозначают бук-вами латинского алфавита с цифровыми индексами (а, а₃, b, c₁, с, f₆), всего их известно более двадцати. В частности в цитохроме с феррипорфири-новый фрагмент в отличие от гема вместо остатков пропионовой кислоты содержит пропильные группы. Цитохромы участвуют также в реакциях окислительного гидроксилирования органических соединений, а пара цитохромоксидаз а-а₃ переносит четыре электрона на молекулу кислорода (аэробные процессы).

В некоторых учебниках по биохимии в качестве универсального кофермента реакций гидрирования-дегидрирования рассматривается также убихинон (ubi – по латыни значит везде, т.е. вездесущий хинон). На самом деле существует несколько соединений этого класса с алкенильными заместителями на основе олигомеров изопрена различной длины (их иногда называют витаминами Q), например:

В частности, из печени млекопитающих выделен убихинон с n = 10, однако это соединение с гидрофобным разветвленным алкильным остат-ком из 50 атомов углерода не предназначено для связывания с белками и поэтому не может претендовать на роль истинного кофермента. Убихинон входит в состав пигментов электронпереносящей цепи в мембранах мито-хондрий. Аналогичный по строению хинон переносит электроны в мембранах хлоропластов в клетках растений при фотосинтезе.

Фолиевая кислота (витамин В_с)

после её превращения в тетрагидрофолиевую кислоту участвует в работе ферментов, переносящих одноуглеродные фрагменты. Так, например, с участием фолатзависимого фермента серин превращается в глицин:

В работе ацилтрансфераз принимает участие кофермент А, обознача-емый CoA-SH. В этом соединении 3‑фосфоаденозиндифосфат соединён его пирофосфатным фрагментом с 2-меркаптоэтиламидом пантотеновой кислоты, которая является обязательным фактором питания (витамин В₅):

3-Гидроксипропиламид 2,4-дигидрокси-3,3-диметилмасляной кисло-ты (пантоевой кислоты) используют для лечения ран и других поражений кожных покровов под названием пантенол:

В этом соединении 3-гидроксиэтиламидный остаток окисляется и превращается в остаток -аланина, т.е. пантенол – это провитамин В₅.

С участием АТФ или в результате обменной реакции с другим тио-эфиром кофермент А ацилируется по сульфгидрильной группе с образова-нием тиоэфира, например ацетилкофермента А (СоА-S-СОСН₃), и снова может переносить ацильные группы на другие молекулы по различным механизмам.

Биотин или витамин Н

выполняет роль простетической группы у карбоксилаз, относящихся к лиазам. Витамин Н достаточно стабилен и авитаминоз по нему встречается только у людей, которые едят много сырых яиц, так как яйца содержат белок, который связывает биотин в прочный комплекс. Биотин присоеди-нён к белковой составляющей фермента за счёт образования амидной связи между карбоксильной группой биотина и концевой аминогруппой лизинового фрагмента в молекуле белка. Это связано с тем, что мочевин-ный участок бициклической системы простетической группы должен с минимальной структурной перестройкой перемещаться на таком поводке из десяти атомов из одного активного центра фермента в другой, так как механизм его действия основан на двух реакциях. Сначала протекает реакция карбоксилирования бикарбонатом с участием АТФ:

После этого уже в другом участке фермента карбоксильная группа перено-сится на другую молекулу. Например, так из пропионил-кофермента А образуется метилмалонил-СоА:

Одним из наиболее изучаемых витаминов является витамин С – аскорбиновая кислота, однако её роль в функционировании ферментов до сих пор не установлена во всех её проявлениях. Предполагается, что аскорбиновая кислота участвует в образовании входящих в состав колла-гена (белок соединительной ткани) 4-гидроксипролина и 5‑гидроксили-зина, и поэтому её присутствие важно для заживления ран. Не исключено и участие аскорбиновой кислоты в ассимиляции неорганического железа.

Сложное строение отличает группу веществ, относящихся к витами-нам В₁₂. Чаще всего витамин В₁₂ представлен кобальторганическим соеди-нением, известным под названием цианкобаламин, раствор которого в воде окрашен в пурпурный цвет. Он выполняет роль кофермента изомераз, функционирующих по радикальному механизму. Источниками кобаламина являются бактерии, в частности бактериальная флора пищеварительного тракта; в растениях витамин В₁₂ отсутствует. В этом соединении атом кобальта встроен в систему из четырёх гидрированных пиррольных колец на основе порфиринов:

Наиболее ярко авитаминоз по В₁₂ проявляется в нарушении процесса кроветворения.

Из других обязательных факторов питания можно назвать витамин А или ретинол:

В организме витамин А выполняет несколько функций. Наиболее из-вестна его роль в зрительном процессе, где он в виде ретиналя, образую-щегося при дегидрировании ретинола, участвует в образовании реагирую-щего на свет пигмента родопсина. Но дефицит по витамину А не ограни-чивается только «куриной слепотой», это всего лишь первый симптом авитаминоза по этому веществу. При недостаточности витамина А появля-ется сухость кожи, глаз (ксерофтальмия), задержка развития и роста, сте-рильность самцов. Но и гипервитаминоз опасен, особенно для беременных женщин.

Витамин Е или токоферол (от греч. токос – потомство, феро – несу)

не является коферментом, он ингибирует реакции с участием свободных радикалов. Его недостаток в рационе вызывает перерождение репродук-тивных органов, нарушение функций мембран, дегенерацию печени, но точная биологическая роль витамина Е не установлена. Много этого витамина содержится в растительных маслах. Синтетический витамин Е, полностью идентичный натуральному, добавляют сейчас в пищевые про-дукты для замедления процессов полимеризации и окисления.

Витамины группы D (они, как отмечалось выше, образуются из эргостерина) относятся скорее к гормонам, так как они регулируют обмен кальция и фосфата.

Витамин К – замещённый метилнафтохинон – участвует в работе нес-кольких факторов свертывания крови, правда, и в этом случае механизм его участия в образовании одного из них – протромбина – не установлен.

Кинетическое описание ферментативных реакций было предложено Михаэлисом и Ментен. В 1913 году эти исследователи предположили, что фермент (Е) и субстрат (S) образуют комплекс (ES, комплекс Михаэлиса)

который превращается в комплекс фермента с продуктом превращения субстрата (ЕР), распадающийся далее на фермент (Е) и продукт (Р).

Основа катализа – снижение энергии активации реакции, и ферменты по способности снижать её превосходят все известные катализаторы. Так, например, разложение пероксида водорода без катализатора требует энер-гии активации 18000 кал/моль, самый активный неорганический катализа-тор – коллоидная платина – снижает её до 11700 кал/моль, а фермент ката-лаза обеспечивает снижение энергии активации до менее 2000 кал/моль. Этиловый эфир масляной кислоты гидролизуется в присутствии кислот с энергией активации (Е_А) 16800 кал/моль, щёлочи снижают значение Е_А до 10200 кал/моль, а панкреатическая липаза (пищеварительный фермент, секретируемый поджелудочной железой) характеризуется энергией акти-вации по этому субстрату, равной 4500 кал/моль. Очень медленно гидро-лизуется водой сахароза, в присутствии кислот этот процесс ускоряется (Е_А = 25600 кал/моль), а дрожжевая инвертаза снижает этот показатель реакции до 8000-10000 кал/моль. В абсолютных величинах это различие выглядит не очень серьёзным, но энергия активации в уравнении Арре-ниуса входит в экспоненциальный множитель

и тогда константа скорости ферментативной реакции (k_е) в логарифми-ческом виде представляется уравнением (Е_А = 8000 кал/моль):

,

а константа скорости реакции, катализируемой протонами (k_h), уравне-нием (Е_А = 25600 кал/моль):

Постоянные реакций В_e и В_h примерно равны и тогда для темпера-туры 37С получаем

что соответствует отношению k_e/k_h = 2,510¹² (двенадцать порядков!).

Что же лежит в основе уникальной избирательности и высокой каталитической активности ферментов? Прежде всего, это особенность пространственного строения белковой молекулы, лежащей в основе этих катализаторов. Форма глобулярного белка во многом определяется гидро-фобными взаимодействиями между структурными элементами входящих в его состав аминокислот. Эти взаимодействия слабы, но когда их много – они дают достаточно значимый выигрыш в энергии. Гидрофобные струк-турные элементы заполняют внутреннюю среду белковой глобулы, однако слабость каждого отдельного взаимодействия позволяет белку в ответ на воздействие на внешнюю сферу (в результате изменения рН или присо-единения другой молекулы) легко перестраиваться, принимая новую фор-му и меняя местами различные функциональные группы боковых цепей аминокислотных фрагментов. Ещё Фишер выдвинул гипотезу о взаимо-действии субстрата с активным центром фермента по принципу «ключ-замок». Очень часто и сейчас используют это представление для схема-тической иллюстрации ферментативного катализа. Однако этот подход слишком упрощён, он не отражает того, что в ответ на связывание с суб-стратом происходит перестройка белковой молекулы фермента, и тогда образующемуся комплексу субстрата с ферментом соответствует минимум энергии уже при ином расположении составляющих фермент структурных элементов, а по мере протекания ферментативной реакции такие пере-стройки белковой молекулы могут происходить неоднократно до отхода продукта реакции от реакционного центра.

В разделе, посвящённом строению белков, уже были представлены данные по третичной структуре миоглобина, рибонуклеазы и лизоцима. Активный центр лизоцима представлен только -спиралями. Расстояние, равное шагу -спирали (0,54 нм) или кратное ему, разделяет атомы с повышенной или с пониженной электронной плотностью во многих субстратах или биологически активных веществах.

Одной из главных особенностей ферментов является реализуемая с их помощью возможность использования свободной химической энергии, за-ключенной в таких макроэргических веществах, как аденозинтрифосфат, для осуществления эндотермических реакций, а также синтез аденозин-трифосфата (АТФ) за счёт использования энтропийного фактора. Однако и без этого ферменты представляют собой уникальные катализаторы, специ-фику которых объясняют перечисленными далее механизмами.