5.3. Дестабилизация связей

Известно, что изменение геометрии связей приводит к их дестабили-зации. В качестве примера можно привести гидролиз ациклического и циклического фосфитов: константа скорости гидролиза этиленфосфита на семь порядков больше константы скорости гидролиза диметилфосфита:

и

,

что связано с разной геометрией связей в этих двух соединениях. К этой же группе возможных влияний относится и изменение характера сольва-тации промежуточных продуктов или переходных состояний. Этот эффект иллюстрируется реакцией декарбоксилирования продукта присоединения пировиноградной кислоты к соли диметилтиазолия, имитирующей in vitro тиаминпирофосфат – кофермент пируватдекарбоксилазы:

В воде продукт присоединения пирувата достаточно устойчив, в спир-те скорость декарбоксилирования возрастает на 4-5 порядков, а в поляр-ном апротонном диметилсульфоксиде скорость декарбоксилирования не удаётся измерить, так как уже при растворении в нём продукта присоеди-нения происходит вспенивание от выделяющегося диоксида углерода.

5.4. Согласованный кислотно-основный катализ

В органической химии известно достаточно большое количество реакций, катализируемых кислотами и основаниями, но только ферменты могут в результате структурной перестройки молекулы последовательно менять окружение у промежуточного соединения, создавая в нанопро-странстве активного центра полярную и неполярную среду, кислую или щелочную среду. В качестве примера можно привести катализируемую лиазой реакцию гидратации фумаровой кислоты:

Фермент фумараза присоединяет молекулу воды по двойной связи фумаровой кислоты с образованием L-яблочной кислоты. Это превраще-ние быстро и избирательно протекает при температуре, не превышающей 40С, благодаря тому, что в активном центре фермента на разные атомы углерода, соединённые двойной связью, одновременно действуют кислота и основание:

Понятно, что у синтетика нет возможности для создания условий с одновременным присутствием в растворе кислоты и основания. Для гидратации двойных связей синтетическим путём приходится, например, нагревать вещество с концентрированной серной кислотой.

5.5. Ингибирование ферментов

Ингибирование ферментов представляется важным как с токсиколо-гической, так и с фармакологической точек зрения. Особое место занима-ют процессы необратимого ингибирования ферментов. Чаще всего это свя-зано с нарушением нативной структуры апофермента. В частности, такими ингибиторами являются ионы тяжёлых металлов, образующих прочные связи с сульфгидрильными группами, алкилаторы, например иодуксусная кислота, которая реагирует по имидазольным фрагментам белка (из гисти-дина) и по другим нуклеофильным центрам. Необратимыми ингибиторами металлопротеиновых ферментов (каталаза, супероксиддисмутаза) являют-ся сильные восстановители (арсин, фосфин), которые изменяют валент-ность ионов участвующих в катализе металлов (марганец, кобальт, желе-зо), переводя их даже в металлическое состояние, а также некоторые кис-лоты (сероводород, синильная кислота), образующие прочные соли с этими металлами. Однако возможны необратимые блокировки ферментов и в результате превращения простетических групп и коферментов. Так, например, гидразиды кислот реагируют с формильными группами в актив-ном центре пиридоксальфосфатзависимых трансаминаз и декарбоксилаз с образованием стабильных гидразонов и нарушают, в частности, биосинтез аминных нейромедиаторов, участвующих в передаче нервных импульсов.

С фармакологической точки зрения наиболее интересны обратимые ингибиторы ферментов. Причём здесь можно выделить три вида ингиби-рования – конкурентное, неконкурентное и бесконкурентное. В случае конкурентного ингибирования речь идёт о включении в активный центр фермента вещества, строение которого подобно строению естественного субстрата (метаболита), поэтому такие вещества часто называют антимета-болитами. В качестве примера можно привести реакцию дегидрирования янтарной кислоты сукцинатдегидрогеназой, протекающую по схеме:

Эта реакция блокируется многими соединениями, сходными по стро-ению с янтарной кислотой, но не способными к реакции дегидрирования. Антиметаболитами янтарной кислоты являются малоновая, щавелевая, глутаровая, фенилпропионовая кислоты. В частности, сродство малоновой кислоты к активному центру фермента даже выше, чем у естественного субстрата: 50%-ное ингибирование фермента происходит при концентра-ции малоната в 50 раз ниже концентрации сукцината. При конкурентном ингибировании пониженную ингибитором скорость реакции можно повы-сить до прежнего значения повышением концентрации субстрата.

Ещё один пример – антиметаболит фолиевой кислоты метотрексат:

Тетрагидрофолиевая кислота переносит одноуглеродные фрагменты с образованием пятичленного цикла (см. с. 106), а её структурный аналог с третичной аминной группой, который может образовываться из метотрек-сата, по этой схеме не реагирует.

Фолиевая кислота синтезируется бактериями с участием п-аминобен-зойной кислоты (обязательный фактор роста многих микроорганизмов). Близкий ей по структуре и по многим свойствам п-аминобензолсульфамид (стрептоцид, антиметаболит п-аминобензойной кислоты)

блокирует биосинтез фолата в бактериях, так как его сульфамидная группа не может вступать в реакцию ацилирования с глютаминовой кислотой.

Этим определяются бактериостатические свойства стрептоцида и та-ких сульфамидных препаратов, как, сульфодиметоксин и другие. Живот-ные получают фолат в готовом виде (это витамин В_с), поэтому их клетки не имеют транспортной системы для п-аминобензойной кислоты, а следо-вательно и для стрептоцида. В отличие от этого метотрексат транспорти-руется в клетки животных вместе с фолатом и связывается с соответству-ющим апоферментом настолько прочно, что даже без образования кова-лентной связи ингибирование им фолатзависимых ферментов носит необ-ратимый характер. В клетки бактерий фолат не поступает, он в них синтезируется, поэтому метотрексат не является бактерицидом. В то же время, более простые антиметаболиты фолата на основе диаминопирими-дина используются в качестве антибактериальных препаратов:

Хлоридин Триметоприм

Ещё одни пример использования структурного подобия представлен противотуберкулезным средством – п-аминосалициловой кислотой (ПАСК), которая аналогична п-аминобензойной кислоте, но отличается от неё присутствием «лишней» гидроксильной группы:

и

В этом случае вероятнее всего реализуется иной механизм биологи-ческой активности, отличный от антиметаболитного, основанного на блокировке активного центра фермента. Транспортная система в мембране микобактерий туберкулеза плохо различает эти два вещества, и ПАСК попадает в цитоплазму патогенов, где проявляются цитотоксические свойства этого вещества, обусловленные присутствием в его структуре токсофорной фенольной группы. В мембранах клеток лёгочной ткани и других поражаемых палочками Коха тканей транспортная система для п‑аминобензойной кислоты отсутствует, а пассивная диффузия через мембраны идёт очень медленно, поэтому ПАСК мало токсична. Правда, эффективность этого противотуберкулезного средства очень низка и принимать ПАСК приходится дозами до десятков граммов в день.

Неконкуретное ингибирование имеет место в тех случаях, когда его эффективность зависит только от концентрации ингибитора и не зависит от концентрации субстрата. Это означает, что неконкуретные ингибиторы связываются белковой молекулой фермента не в активном центре, а в дру-гом (греч. алло) месте, причем это может быть регуляторный центр алло-стерического фермента или участвующий в перестройке структуры белка «гидрофобный карман». С кинетической точки зрения при неконкуретном ингибировании возможно образование двух заблокированных комплексов по схеме:

или

Поскольку место связывания неконкурентного ингибитора не совпа-дает с местом связывания субстрата, структуры неконкуретных ингибито-ров чаще всего не имеют ничего общего со структурами субстратов, а их взаимодействие с ферментами носит обычно необратимый характер. При неконкуретном ингибировании снижение скорости реакции соответствует снижению концентрации катализатора, поэтому за счёт повышения кон-центрации субстрата компенсировать действие ингибитора не удаётся.

По типу второй реакции протекает и так называемое бесконкуретное ингибирование

,

но в этом случае ингибитор вместе с субстратом занимает каталитический центр.