10.5. Биосинтез пептидов и белков

Биоактивные пептиды, выполняющие роль специфических внутри-клеточных реагентов (например, глутатион), нейромедиаторов или гормо-нов, синтезируются различными путями. Если в клетке должен поддержи-ваться постоянный уровень какого-либо короткоцепочечного пептида, то синтез его идёт по обычной схеме ферментативного катализа путем после-довательного ацилирования аминокислот с помощью универсального источника свободной химической энергии аденозинтрифосфата (АТФ). Так, например, глютатион, который содержится во всех живых клетках и является носителем до 90% всех небелковых тиольных групп в клетках млекопитающих, синтезируется в две стадии. Сначала глютаминовая кис-лота и цистеин при катализе -глютамилцистеинсинтетазой в присутствии АТФ реагируют с образованием -глютамилцистеина; АТФ при этом разлагается на АДФ и фосфат:

Промежуточным продуктом в этой реакции является смешанный ангидрид глютаминовой кислоты по ‑карбоксильной группе и аденозин-дифосфата по концевому фосфатному остатку. На второй стадии по анало-гичной схеме ‑глютамилцистеин и глицин реагируют в присутствии АТФ при катализе глутатионсинтетазой с образованием этого необычного трипептида:

Однако чаще всего небольшие пептидные молекулы образуются пу-тём гидролитического расщепления полипептидов или белков неизбира-тельными или специфическими ферментами. В качестве примера можно привести образование ангиотензина, октапептида с гормональной актив-ностью, который участвует в регуляции кровяного давления. В печени образуется сывороточный белок ангиотензиноген, из которого под дейст-вием фермента ренина в почечной ткани образуется неактивный декапеп-тид ангиотензин I (Асп-Арг-Вал-Тир-Иле-Гис-Про-Фен-Гис-Лей). При по-явлении необходимости в активном ангиотензине II с С-конца ангиотензи-на I ангиотензин-I-конвертирующий фермент, относящийся к гидролазам, отщепляет два аминокислотных фрагмента Гис-Лей. На блокировке этого избирательного фермента основано действие современных средств для ле-чения гипертонии – энапа (эналаприла), каптоприла (капотена) и других. Такой путь образования гормонов пептидной природы позволяет централь-ной нервной системе быстро и эффективно регулировать их содержание в крови. Аналогично поддерживается уровень такого важного пептидного гормона, как инсулин (см. с. 182).

Ещё один пример представлен образованием тетрапептида, стимули-рующего высшую нервную деятельность, из адренокортикотропного гор-мона (АКТГ). Аминокислотная последовательность этого секретируемого гипофизом гормона, состоящего из 39 аминокислот, включает последо-вательность Мет-Глу-Гис-Фен (от четвертой до седьмой аминокислоты с N‑конца). Соответствующий этой последовательности тетрапептид в незначительном количестве образуется при протеолизе АКТГ. На его основе получено одно из немногих лекарств пептидной природы с широ-ким спектром действия – семакс (Мет-Глу-Гис-Фен-Про-Гли-Про).

Принцип последовательного соединения аминокислот в белковые мо-лекулы, включающие чаще всего несколько сотен аминокислот, при ката-лизе избирательными ферментами на каждой стадии невозможен, посколь-ку число таких ферментов превысит все разумные пределы. Это тем более очевидно, что последовательность аминокислот в белке закодирована в молекуле мРНК, согласование кодонов которой с активными центрами каждого из таких ферментов привело бы к ещё большему усложнению задачи. Вот почему для синтеза белков живая природа использует уни-кальный механизм, реализуемый в рибосомах, состоящих из двух субъ-единиц, каждая из которых включает несколько десятков белков и одну или две молекулы РНК (так называемые рибосомальные РНК, рРНК); на долю рРНК в рибосомах приходится около 65% их общей массы. Для узнавания аминокислоты комплексом рибосомы и мРНК служат транс-портные РНК (тРНК), к которым избирательные ферменты присоединяют соответствующие белковые аминокислоты.

Каждая молекула тРНК состоит из примерно 80 нуклеотидов, многие из которых модифицированы (чаще всего они метилированы). Спаренные основания в молекулах тРНК образуют четыре коротких спирали, три из которых заканчиваются петлями. Если молекулу тРНК расположить в плоскости, то она будет иметь форму клеверного листа, который, правда, больше похож на крест. Начало и конец линейной молекулы тРНК обра-зуют спираль, которой противостоит спираль с петлёй, включающей анти-кодон, предназначенный для связывания с кодоном мРНК. Концевой участок тРНК (чаще всего он состоит из четырёх нуклеотидов, где три последних это -ССА) не вовлечён в образование водородных связей с начальным участком тРНК, это так называемый 3‑конец.

Синтез белка начинается с того, что карбоксильная группа аминокис-лоты ацилирует гидроксильную группы в рибозидном фрагменте тРНК с 3‑конца соответствующей этой аминокислоте тРНК. Активация карбок-сильной группы идёт по обычному механизму с участием АТФ, превра-щающегося при этом в АМФ и пирофосфат. Поскольку пирофосфат разла-гается пирофосфатазой на две молекулы фосфата, этот процесс экви-валентен расходованию двух молей АТФ. Катализ этой реакции осущест-вляют аминоацил-тРНК-синтетазы, специфичные по каждой аминокислоте и по каждой соответствующей ей тРНК (для некоторых аминокислот мо-жет быть несколько тРНК). После образования аминоацилзамещённой тРНК аминокислота больше не участвует в распознавании, т.е. каталити-ческий центр рибосом, предназначенный для образования пептидных связей, неизбирателен, он универсален для всех связанных с соответст-вующими тРНК аминоацильных остатков.

Организующая поверхность (мРНК) и аминоацилзамещённые тРНК встречаются на рибосомах, где и идёт сборка полипептидной цепи. В клетках животных основная масса рибосом связана с эндоплазматическим ретикулумом («шероховатый» ретикулум).

В синтезе белка выделяют три стадии – инициация, элонгация и терминация. Синтез белковой молекулы начинается с инициирующей тРНК, связанной с N-формилметионином в прокариотических клетках и с метионином в эукариотических клетках. Это означает, что в эукариоти-ческих клетках кроме тРНК^Met, предназначенной для введения в состав белка молекулы метионина в процессе элонгации, есть ещё одна тРНК^Met, принимающая участие в инициации синтеза белка.

На большой и на малой субъединицах рибосомы есть два центра свя-зывания, обозначаемые буквами Р и А: пептидилсвязывающий центр (Р) и аминоацилсвязывающий центр (А). Для образования синтезирующего бе-лок комплекса от рибосомы отходит малая субъединица и связывается с мРНК. Затем к комплексу мРНК и малой субъединицы рибосомы присо-единяется инициирующая метионил-тРНК^Met (у прокариот это формил-метионил-тРНК^fMet), т.е. специфичность связывания определяется антико-доном на метионил-тРНК^Met и соответствием этой инициирующей амино-ацилированной тРНК пептидилсвязывающему центру. После этого с учас-тием гуанозинтрифосфата, разлагающегося при этом на гуанозиндифосфат и фосфат, происходит присоединение большой субъединицы рибосомы к комплексу, состоящему из малой субъединицы рибосомы, мРНК и иници-ирующей метионил-тРНК^Met. В этом сложном процессе принимают участие белковые факторы инициации (IF, IF2 и IF3).

Далее идёт процесс элонгации, когда к аминоацилсвязывающему центру в соответствии с кодоном на мРНК подходит другая соответст-вующая ему тРНК, несущая аминоацильный остаток. В этом снова участ-вуют вспомогательные белки, называемые факторами элонгации, а энергию для связывания снова поставляет ГТФ. В состав рибосомы входит фермент пептидилтрансфераза, в активном центре которой оказываются ацилированные аминокислотами 3‑концы инициирующей метионил-тРНК^Met и второй тРНК. При катализе этим ферментом метионильный остаток ацилирует аминогруппу связанной с тРНК аминокислоты, в результате чего в пептидилсвязывающем центре оказывается тРНК^Met со свободными гидроксильными группами в 2- и 3-положении, а в аминоацилсвязывающем центре тРНК с дипептидильным остатком, например:

Свободная инициирующая тРНК^Met покидает пептидилсвязывающий центр, и происходит одновременное смещение мРНК и тРНК с дипепти-дильным остатком в освободившийся пептидилсвязывающий центр. Энер-гию для этого снова поставляет ГТФ. В освободившемся аминоацил-связывающем центре оказывается третий кодон мРНК, после этого сюда подходит третья мРНК с соответствующей аминокислотой, и процесс повторяется уже с переносом на аминоацильный остаток дипептидильного остатка.

Так наращивание последовательности аминокислот в белке идёт до тех пор, пока в аминоацилсвязывающем центре не окажется «бессмыслен-ный» кодон (терминирующие триплеты UAA, UAG и UGA). Теперь к работе рибосомы подключаются факторы терминации, вызывающие гидролитическое отщепление белка (полипептида) от последней тРНК, отделение от пептидилсвязывающего центра свободной тРНК и диссо-циацию рибосомы на малую и большую субъединицы для того, чтобы можно было начать новый цикл синтеза белка со стадии инициации.

Энергетическая стоимость образования одной пептидной связи на рибосоме эквивалентна расходованию четырёх молекул АТФ, что значи-тельно выше, чем при ферментативном катализе образования пептидной связи. Напоминаем, что при образовании аминоацилированной тРНК АТФ разлагается на АМФ и два моля фосфата, а при элонгации расходуется ещё два моля ГТФ на связывание аминоацилированной тРНК и на перемеще-ние её из аминоацилсвязывающего центра в пептидилсвязывающий центр. Для наработки большого количества белка на одной молекуле мРНК могут одновременно вести его синтез несколько рибосом.

По мере элонгации молекулы белка идёт его сворачивание в трёхмер-ную структуру (фолдинг), но синтез молекулы начинался с метионина (формилметионина у прокариот) и далеко не все белки или полипептиды имеют его в качестве N-концевой аминокислоты. Это означает, что после отделения от рибосомы полипептидной молекулы должен пройти гидро-лиз на её N-конце с отщеплением остатка метионина (обычно отщепление затрагивает несколько аминокислотных остатков). Кроме того, синтезиро-ванные в клетке белки часто должны пройти через клеточные мембраны для того, чтобы проникнуть в какие-либо клеточные органеллы или выйти из клетки. Для этого синтезируемый рибосомой белок содержит в N‑кон-цевой области полипептидную последовательность из 15-30 аминокислот с гидрофобными радикалами, её называют сигнальной последователь-ностью. Она «протаскивает» белковую молекулу через соответствующую мембрану и после этого также отщепляется. Постсинтетическое превраще-ние белка, включающее иногда и химическое превращение радикалов аминокислот в полипептидной цепи, называют процессингом, он включает также повторный фолдинг трасформированной белковой молекулы.

Синтез белка нарушается многими биологически активными вещест-вами синтетического или природного происхождения. В качестве примера можно привести антибиотик хлорамфеникол

,

подавляющий синтез белка рибосомами прокариот и митохондрий, но не влияющий на работу внемитохондриальных рибосом эукариот.

Ещё один антибиотик пуромицин

имитирует 3-конец фенилаланиновой или тирозиновой тРНК с соответ-ствующей аминокислотой; его действие основано на конкурентом встраи-вании в активный центр пептидилтрансферазы рибосомы, где он ацили-руется уже образовавшимся пептидильным остатком на тРНК. Это приво-дит к образованию укороченных пептидных молекул с пуромициновым фрагментом на С-конце.