12. Метаболизм ксенобиотиков
Объекты живой природы постоянно вступают в контакт с огромным числом разнообразных химических соединений. Они входят в состав про-дуктов питания, содержатся в воде, поступают с вдыхаемым воздухом, и это не только необходимые организму белки, углеводы, жиры, витамины, соли, кислород, но и не представляющие пищевой ценности или даже ток-сичные компоненты естественного (эфирные масла, окрашенные вещества, алкалоиды, таннины, токсины и др.) или искусственного происхождения: консервирующие, вкусовые и ароматизирующие добавки, агрохимические препараты, а также оставшиеся в продуктах питания лекарственные и гормональные препараты, которые добавляли в корм птице или скоту. Независимо от их происхождения, не участвующие в нормальном течении обменных процессов вещества, поступающие в организм, называются ксенобиотиками. Их отрицательное воздействие особенно сильно проявля-ется в индустриальных зонах с загрязнённой окружающей средой.
Поскольку многие ксенобиотики токсичны, живые системы для выжи-вания должны иметь механизмы для их обезвреживания и выведения из сред, где идут нормальные метаболические процессы. У растений все отходы жизнедеятельности собираются в вакуолях – окруженных мембра-ной клеточных образованиях. В вакуолях действуют очень эффективные ферменты с гидролазной активностью. Нарушение целостности мембраны вакуоли приводит к гибели растительной клетки, так как содержащиеся в ней ферменты разрушают белки и другие гидролизующиеся компоненты цитозоля. Чем старше растительная клетка или чем более насыщена ксено-биотиками среда, в которой она находится, тем большее пространство клетки занимает вакуоль. У животных есть выделительная система, и ксе-нобиотики, так или иначе попавшие в кровь, могут быть выведены через почки. Правда, физиология почек такова, что они переводят в мочу только растворимые в воде вещества. Неполярные гидрофобные вещества образу-ют комплексы с транспортными белками крови и в таком виде почками не выводятся. Из этого следует, что гидрофобные ксенобиотики должны пре-вращаться биохимическими системами в растворимые производные.
Метаболизм ксенобиотиков протекает преимущественно в печени с помощью неселективных ферментов. Низкая селективность ферментов, предназначенных для метаболизма ксенобиотиков, обусловлена тем, что полный набор избирательных ферментов для всех возможных веществ (а их уже синтезировано более 10 миллионов) нереализуем. Предназначен-ные для метаболического превращения ксенобиотиков ферменты должны быть достаточно универсальными для катализа превращений субстратов с широким набором функциональных групп в широком диапазоне молеку-лярных масс и пространственных особенностей. Низкая избирательность этих ферментов не позволяет им различать ксенобиотики и эндогенные вещества, и поэтому они вызывают превращение и многих необходимых для течения нормальных метаболических процессов субстратов и регуля-торов метаболизма. Понятно, что при отсутствии в организме ксенобиоти-ков содержание этих ферментов должно быть минимальным, а появление ксенобиотиков должно индуцировать биосинтез этих ферментов.
В этом состоит первый серьёзный недостаток реализуемой в живой природе системы обезвреживания ксенобиотиков – она атакует любые молекулы, в том числе и такие жизненно важные для организма вещества, как, например, гормоны, нейромедиаторы, субстраты, метаболиты, белки и многие другие участвующие в обеспечении существования организма мо-лекулы. Но несовершенство системы, предназначенной для биотрансфор-мации ксенобиотиков, этим не ограничивается. Введение полярных функ-циональных групп в инертные и неполярные молекулы чаще всего сопро-вождается их метаболической активацией с образованием интермедиатов с высокой реакционной способностью. Если эти промежуточные соединения не будут полностью трансформированы в течение кратчайшего времени, то появляется риск химического повреждения ими таких биомолекул, как белки, ДНК и РНК. Наибольшую опасность представляют эпоксиды, кар-бониевые ионы, ионы нитрония и другие электрофильные продукты пре-вращений. Они взаимодействуют с белковыми молекулами и с нуклеино-выми кислотами, приводя к истощению иммунной системы, к нарушению нормального течения метаболизма и к мутациям в структуре ДНК. Следст-вием таких превращений, сопровождающих метаболизм ксенобиотиков, могут быть цирроз печени, раковые заболевания и другие повреждения систем жизнеобеспечения.
В качестве примера можно привести действие неизбирательной моно-оксигеназы на женский половой гормон эстрадиол. Его ароматический цикл в результате такого ферментативного окисления превращается в соот-ветствующий ареноксид, и следствием этого становится не только сниже-ние концентрации гормона. Гораздо более серьёзные последствия связаны с высокой мутагенной и канцерогенной активностью образующегося при этом соединения:
Когда в 40-е годы ХХ столетия началось интенсивное исследование химического канцерогенеза, появилась надежда, что проблема онкологи-ческих заболеваний будет решена в кратчайшие сроки. В основе идеи лежали представления о возможности выявления канцерогенных функцио-нальных групп в химических соединениях. Предполагалось, что, исключив возможность контакта людей с такими веществами, можно будет изба-виться от злокачественных опухолей. Но спектр веществ с канцерогенной активностью постоянно расширяется (канцерогенен даже химически инертный асбест) и, кроме того, химический канцерогенез это всего лишь один из факторов, способствующих возникновению этой болезни. На современном уровне понимания проблемы можно только утверждать, что одной из причин возникновения злокачественных опухолей является мета-болическая активация клеточными ферментами поступающих в организм ксенобиотиков с образованием промежуточных продуктов, которые могут взаимодействовать с нуклеофильными центрами в ДНК.
Мутагенная активность веществ может быть выявлена в достаточно простом опыте на мутантной форме бактерии Salmonella, которая нужда-ется для роста в гистидине. Для проверки такой штамм наносят на пита-тельную среду, лишенную гистидина и прибавляют исследуемое вещество или исследуемое вещество вместе с гомогенизированными клетками пече-ни крысы. Если в присутствии исследуемого вещества появляются коло-нии бактерий, которые могут жить без гистидина (прошла обратная мута-ция), то это означает, что само вещество является мутагеном. Если же такие колонии появляются только при совместном действии исследуемого вещества и гомогенизата клеток печени, то это означает, что мутагенная активность является следствием метаболической активации исследуемого вещества. Точность теста (Б. Эймс) достигает 90%.
Большинство наших представлений о реакциях, сопровождающих ме-таболизм ксенобиотиков, является результатом изучения метаболических превращений лекарственных веществ. Эти ферментативные реакции носят общий характер для всех теплокровных, хотя, конечно, существуют и определённые количественные различия как между видами, так и между отдельными особями одного вида. На уровне отдельных индивидов важ-ную роль в метаболизме ксенобиотиков играют генетические факторы, возраст, пол, гормональный баланс, особенности микрофлоры желудочно-кишечного тракта, перенесённые болезни (особенно, если это болезни печени), образ жизни и т.д.
Один из вариантов классификации путей метаболизма ксенобиотиков был предложен Вильямсом (1959 г.). Он выделил две фазы превращений. В первой фазе в молекулу вещества вводятся новые функциональные группы или модифицируются существующие. Во второй фазе происходит присо-единение к появившимся в результате первичного превращения функцио-нальным группам высокополярных (часто ионных) структурных элемен-тов, например, остатков глюкуроновой кислоты, серной кислоты, амино-кислотных остатков. В результате такого сочетания повышается раствори-мость трансформированного вещества в воде и становится возможным его выведение через почки. Подавляющее большинство поступающих в орга-низм ксенобиотиков проходит обе фазы метаболического превращения.
Самый распространенный тип реакций первой фазы метаболизма ксенобиотиков представлен реакциями окисления. Они протекают в при-сутствии монооксигеназ или, иначе, оксидаз смешанных функций, назы-ваемых также цитохромами Р450 (450 нм – это длина волны поглощаемого комплексом цитохрома и монооксида углерода света). Наряду с неизбира-тельными монооксигеназами, катализирующими окисление ксенобиоти-ков, в организме есть также избирательные ферменты этого семейства, обеспечивающие, например, превращение фенилаланина в тирозин и далее в адреналин, и участвующие в биосинтезе и в превращениях стероидов (гормоны, компоненты мембран) и т.д.
Оксидазами смешанных функций эти ферменты называют потому, что в их работе участвует восстановительный потенциал в виде NADРН. Эти NADРН-зависимые ферменты катализируют большое число реакций гидр-оксилирования, эпоксидирования и другие превращения, используя в ка-честве окислителя молекулу кислорода. При этом один атом кислорода встраивается в субстрат, а второй окисляет NADРН с образованием воды. В активном центре фермента молекула кислорода связывается с атомом железа гемового кофермента и активируется для реакции с органическим субстратом. Активированный атом кислорода встраивается по связям С-Н, N-Н, S-Н, С=С и т.д. Монооксигеназа с восстановленным гемом (Fe2+) связывает в активном центре субстрат RH (1) и молекулу кислорода (2). Затем один атом молекулы кислорода при участии флавопротеинового (FP) и никотинамидадениндинуклеотидфосфатного (NADPH+H+) комплекса ферментов окисляет субстрат, второй атом кислорода образует воду (желе-зо при этом окисляется и остаётся один электрон) (3). После этого окислен-ный субстрат (ROH) отходит от активного центра, его место занимает окисляемый субстрат (RH) (4), а оставшийся на стадии 2 3 электрон восстанавливает атом железа и система возвращается в исходное состояние (1). Одно из представлений механизма действия монооксигеназ иллюстри-руется следующей схемой:
Обеспечивающая окислительную трансформацию ксенобиотиков ферментная система цитохрома Р450, как уже отмечалось выше, относится к индуцируемым ферментам. Это означает, что содержание фермента и его активность повышаются в ответ на появление в организме ксенобиотиков. Для этого используется обычный механизм активации генов, отвечающих за биосинтез белков. Прошедший через липидный слой мембраны гидро-фобный ксенобиотик связывается с рецепторным белком, в виде такого комплекса проходит в ядро клетки и запускает процесс транскрипции на соответствующем участке хромосомы. Образовавшаяся мРНК покидает ядро и становится матрицей для синтеза белковой составляющей моно-оксигеназы. Индукторами монооксигеназ являются полициклические аро-матические углеводороды, многие лекарственные вещества (например, фенобарбитал), входящие в состав продуктов питания флавоны, произ-водные индола, ксантины и др. Монооксигеназы, предназначенные для биотрансформации ксенобиотиков, локализованы в гладком эндоплазмати-ческом ретикулуме клеток печени. При гомогенизации ткани печени этот ретикулум образует микросомы (отсюда ещё одно название таких моно-оксигеназ – микросомальные оксигеназы).
В реакциях биохимического окисления алканов и алкильных остатков сложных молекул гидроксилированию подвергаются концевые группы или предпоследний атом углерода в цепи. Так, например, основным продуктом метаболического превращения гексана является гексан-2-ол. С соединени-ями, содержащими функциональные группы, реакция идёт по функцио-нальной группе или по ближайшему к функциональной группе атому углерода, например:
В соответствии с этим олефины окисляются в аллильное положение или эпоксидируются, а анизол окисляется по метильной группе с образова-нием полуацеталя, который распадается на фенол и формальдегид, т.е. идёт реакция О-деалкилирования:
По аналогичной схеме жаропонижающее средство фенацетин деалки-лируется с образованием парацетамола (панадола):
Ароматические углеводороды также окисляются в реакциях с участи-ем цитохромов Р450. Бензол и многие замещённые бензолы превращаются при этом в фенолы. Сначала предполагалось, что реакция протекает просто за счёт внедрения атома кислорода по С‑Н-связи, но затем было показано, что промежуточными продуктами этой реакции являются ареноксиды. Перегруппировка ареноксидов в фенолы или NIH-сдвиг (National Institute of Health, США) протекает без участия ферментов:
Это было доказано элегантными опытами с дейтериевыми метками. NIH-Сдвиг включает гетерогенный разрыв одной из связей эпоксида, сдвиг гидридиона в соседнее положение и таутомерное превращение образовав-шегося ненасыщенного кетона с восстановлением ароматической структу-ры. Образующийся из бензола ареноксид – это сильнейший алкилатор, его токсическое действие особенно ярко проявляется на клетках костного мозга, поэтому везде, где это возможно, бензол надо заменять толуолом. В отличие от бензола толуол окисляется монооксигеназами с образованием гораздо менее токсичного бензилового спирта.
В молекулах с аминогруппами окисление может идти как по атомам углерода, так и по атому азота. В первом случае идёт реакция деалкили-рования, а во втором образуются токсичные гидроксиламины, например:
Третичные амины могут быть окислены до N-оксидов. Одним из серь-ёзных экологических загрязнителей является 3,4,3,4-тетрахлоразобензол, образующийся в природе из агрохимических препаратов на основе 3,4-ди-хлоранилина. Этот замещённый азобензол является индуктором образова-ния монооксигеназ, но его ферментативное окисление по пассивирован-ным заместителями ароматическим С-Н-связям практически не идёт. В организме теплокровных он превращается в N-оксид, который снова легко восстанавливается NADH-зависимыми ферментами в соответствующий азобензол:
Из-за этого его превращение в растворимую в воде форму и выведе-ние оказывается невозможным, и он накапливается в организме, создавая при этом повышенный фон монооксигеназ, что, как уже отмечалось выше, приводит к истощению ресурса иммунной системы и ко всему спектру связанных с этим заболеваний, включая злокачественные опухоли. Тяжё-лая экологическая ситуация в района Арала связана загрязнением вод 3,4,3,4-тетрахлоразобензолом. Ещё более токсичен 2,3,6,7-тетрахлор-дибенздиоксин, образующийся из хлорфенолов и при сжигании хлориро-ванных органических соединений:
Атомы серы в ксенобиотиках и в различных биохимических структу-рах легко окисляются монооксигеназами. Лекарственный препарат хлор-промазин (аминазин), используемый для лечения некоторых психических заболеваний, окисляется цитохромами до соответствующего сульфоксида:
Второй тип реакций первой фазы биотрансформации ксенобиотиков – это восстановление. Реакции восстановления ксенобиотиков встречаются гораздо реже, чем реакции окисления, но этот механизм превращений ва-жен для перевода в амины нитро- и азосоединений. Восстановление нитро-групп катализируется нитроредуктазами и оно также идёт с промежуточ-ным образованием токсичных нитрозосоединений и гидроксиламинов.
Восстановительное расщепление азогруппы было изучено на примере азокрасителя красного цвета пронтозила («красный стрептоцид»), показав-шего хорошие бактерицидные свойства. Оказалось, что сам краситель малоактивен, но в бактериях он легко восстанавливается с разрывом связей между атомами азота и превращается в триаминобензол и бактерицидный амид сульфаминовой кислоты («белый стрептоцид»), который представ-ляет собой антиметаболит п-аминобензойной кислоты, участвующей в бак-териях в биосинтезе фолиевой кислоты:
Стрептоцид стал лидерным соеди-нением в синтезе большого числа антибактериальных препаратов из группы сульфамидов.
Третий путь превращений в первой фазе биотрансформации ксено-биотиков представлен реакциями гидролиза. На сложных эфирах они про-текают при катализе эстеразами, на амидах – амидазами. Эти ферменты присутствуют в крови, в печени и во многих тканях тела. Скорости гидро-лиза подчиняются общим химическим закономерностям: эфиры гидроли-зуются легче чем амиды, а стерические факторы и в ферментативном гидролизе очень важны. Самый известный пример такого превращения представлен гидролизом ацетилсалициловой кислоты (аспирин) с образо-ванием салициловой кислоты, т.е. по современной фармакологической терминологии аспирин представляет собой пролекарство, так как именно салициловая кислота отвечает за лекарственную активность аспирина:
Известное местное обезболивающее средство – новокаин – гидролизу-ется с образованием п-аминобензойной кислоты и диэтиламиноэтанола:
Новокаин блокирует болевые ощущение на один-два часа. Другой гораздо более эффективный местный анестетик лидокаин, амид 2,6-диме-тиланилина и N,N-диэтилглицина, обеспечивает блокаду болевых ощуще-ний на время до шести часов:
Анилид диэтилглицина без метильных групп, экранирующих амид-ную связь, тоже проявляет свойства анестетика местного действия, но ско-рость его гидролиза в 100 раз выше, чем у лидокаина. Высокая скорость гидролиза исключает возможность использования его в качестве лекарст-венного средства, так как его действие ограничивалось бы минутами.
Метаболическая детоксикация электрофильных ксенобиотиков (на-пример алкилгалогенидов и эпоксидов) протекает с участием глютатиона. Этот трипептид – -глютамилцистеинилглицин,
содержит нуклеофильную тиольную группу, которая легко вступает в реакции с алкилаторами и легко окисляется с образованием дисульфидной связи. Глютатион, для которого в биохимии используется обозначение GSН, содержится в тканях печени и почек в концентрации около 10 ммоль/л. Это вещество используется клетками не только для детокси-кации электрофильных ксенобиотиков. Судя по всему, глютатион прини-мает также участие в регуляции окислительно-восстановительного потен-циала в клетках организма и в нейтрализации свободных радикалов. На этом основано использование глютатиона в средствах для лечения онко-логических заболеваний.
Взаимодействие глютатиона с электрофильными реагентами было по-казано на примере метаболической трансформации нафталина. В организ-ме нафталин окисляется с образованием соответствующего ареноксида, который реагирует с глютатионом по схеме:
Образующееся производное глютатиона гидролизуется по пептидным связям с отщеплением остатков глютаминовой кислоты и глицина, а свя-занный с ксенобиотиком остаток цистеина ацетилируется по аминогруппе, и из организма выводится уже производное меркаптуровой кислоты (N‑ацетилцистеина):
Галогензамещённые соединения с алкилирующей способностью обез-вреживаются глютатионом с участием глютатионтрансфераз по обычной схеме с образованием тиоэфиров, например:
Ксенобиотики с функциональными группами и продукты их превра-щений в первой фазе метаболизма не всегда имеют достаточную раствори-мость для выведения их через почки. Для их гидрофилизации используется вторая фаза метаболизма, представляющая собой реакцию конъюгации (сочетания) с сахарами или с их производными или же с аминокислотами и простейшими пептидами. В редких случаях для этого используются также реакции сочетания с неорганическими кислотами, так как концентрация их солей в жидких средах организма поддерживается в очень узких рамках, а потери не так легко восполнить.
Реакции конъюгации протекают с участием гидроксильных, аминных, карбоксилатных или тиольных групп, которые могли присутствовать в ксенобиотике изначально или образовались на первой фазе метаболизма. У теплокровных вторая фаза метаболизма чаще всего представлена образова-нием глюкуронидов – производных глюкуроновой кислоты по аномерной гидроксильной группе.
Конъюгация метаболизированного на первой стадии ксенобиотика с остатком глюкуроновой кислоты протекает в результате взаимодействия соответствующей функциональной группы ксенобиотика с уридиндифос-фатглюкуроновой кислотой, которая образуется из глюкозо-1-фосфата, аденозинтрифосфата (АТФ) и уридинмонофосфата с последующим окис-лением концевой гидроксиметильной группы до карбоксилатной.
Так, например, фенол выводится из организма после его превращения в глюкуронид по реакции с уридиндифосфатглюкуроновой кислотой с одновременной защитой токсофорной гидроксильной группы (U – остаток урацила, R – остаток рибозы и РР – пирофосфатный остаток):
Эта реакция катализируется глюкуронилтрансферазой – ферментом, локализованным в клетках печени.
Как уже отмечалось, образование сульфатов используется живой при-родой реже, чем образование глюкуронидов. И все же сульфатные произ-водные в ограниченном объёме используются для выведения из организма спиртов, фенолов и ароматических аминов. Их образование включает три стадии: из сульфатного аниона и АТФ образуется аденозин-5-сульфат, который затем фосфорилируется с участием АТФ по 3-положению, и уже этот смешанный ангидрид (PAPS – 3-фосфоаденозин-5-фосфосульфат) переносит сульфатный остаток на субстрат. Вот так, например, в виде растворимого в воде сульфата выводится из организма активное начало панадола (А – остаток аденина):
Ацилирование – это обычная реакция второй фазы трансформации ксенобиотиков, используемая для выведения из организма токсичных кислот. В этом случае ацилированию ксенобиотиками с кислотными груп-пами подвергаются полярные аминокислоты (например, глицин или глют-аминовая кислота), гораздо реже в этом превращении участвуют серин, аспарагиновая кислота, орнитин или таурин (H2NCH2CH2SO3H). В отличие от предыдущих реакций глюкуронирования или сульфатирования в этом случае активируется сам ксенобиотик. Его кислотная группа реагирует с АТФ и коферментом А с образованием ацилированного по атому серы кофермента А. Тиоэфиры являются хорошими ацилирующими средствами, тем не менее перенос ацильных остатков на соответствующие аминокис-лоты катализируется специфичными ацилтрансферазами. Так, например, токсичная бензойная кислота выводится из организма в виде гиппуровой кислоты, образующейся по схеме:
Как отмечалось выше, взаимодействие ксенобиотиков с моноокси-геназами может приводить к продуктам, которые опаснее исходных соеди-нений. Так, например, с образованием эпоксидов чаще всего окисляются входящие в состав душистых масел растений замещённые аллилбензолы:
Представленные вещества, эстрагол и сафрол, содержатся в эфирных маслах укропа, сельдерея и других душистых растений. Образующиеся из них эпоксиды обезвреживаются глютатионом, но часть их реагирует с биологическими мишенями, образуя аллергены и вызывая мутации.
Образование ареноксидов и эпоксидов лежит в основе канцерогенного действия полиядерных ароматических соединений. В продуктах пиролиза органических соединений (табачный дым, выхлопные газы) содержатся значительные количества бензопирена. Это вещество окисляется по 7,8-по-ложению с образованием эпоксида, оксирановый цикл которого легко раскрывается эпоксидгидратазой:
Однако, при повторном акте окисления образуется эпоксид, который уже не гидролизуется эпоксидгиратазами:
Он встраивается по принципу интеркаляции в ДНК и после этого алкилирует азотные функции, вызывая химические превращения этого носителя наследственной информации. До 80% поступившего в организм подопытных животных бензопирена реагирует по этой схеме.
Ещё один пример токсического превращения в присутствии моно-оксигеназ показан на парацетамоле. Этот широко рекламируемый мягкий анальгетик можно купить без рецепта, но в высоких дозах парацетамол вызывает поражения тканей печени и почек. Известны даже случаи леталь-ных исходов от передозировки этого лекарства (вкусный детский пана-дол!). Как было показано выше (с. 242), это вещество вступает в реакции сочетания с образованием глюкуронида или сульфата, но наряду с этим идёт и реакция окисления по атому азота с образованием замещённой ацет-гидроксамовой кислоты, которая дегидратируется и превращается в ток-сичный N-ацетилхинонимин:
N-Ацетилхинонимин легко присоединяется к нуклеофильным цент-рам с восстановлением ароматической структуры. Понятно, что его дейст-вие на белки приводит к образованию аллергенов, а ДНК подвергается мутациям.
Альтернативный анальгетик аспирин гидролизуется с образованием салициловой кислоты, которая окисляется с образованием полигидрокси-бензоатов. Их окисление также может приводить к токсичным хинонам, например:
Такая активация салициловой кислоты может лежать в основе аспи-риновой астмы, представляющей собой аллергическую реакцию на аспирин.
Ещё один вариант окислительных превращений связан с галогениро-ванными алифатическими соединениями. Известна высокая гепатотоксич-ность многих хлорированных углеводородов. Полного понимания меха-низма этого эффекта пока нет, но можно предположить, что в его основе лежит образование веществ с ацилирующей способностью и свободных радикалов. В простейшем случае это можно представить на примере окис-ления хлороформа, который при этом превращается в фосген:
В заключение по этому разделу можно сказать, что точного представ-ления о всех меха-низмах биохимической трансформации ксенобиотиков пока получить не удалось. Однако приведённые здесь примеры позволяют оценить риск, связанный с работами по синтезу новых химических соеди-нений, и с пониманием подходить к проблемам практического использова-ния веществ, которые могут подвергаться биохимически превращениям с образованием токсичных веществ или индуцировать образование неизби-рательных монооксигеназ.