13. Клетки и активный кислород

Кислород участвует в метаболических превращениях аэробных орга-низмов различными путями. В их числе, например, окислительное фосфо-рилирование, фотофосфорилирование и окислительные превращения в нормальном метаболизме и в биотрансформации ксенобиотиков. В случае окислительных превращений различные оксигеназы вводят в структуру субстратов один или два атома кислорода. В частности, оксигеназы смешанных функций, представляющие собой гемопротеины, окисляют СН‑связи с образованием гидроксилированных производных, а двойные связи могут окисляться с образованием эпоксидов (см. раздел 12). В окис-лительном фосфорилировании идёт перенос электронов от восстановлен-ного никотинамидадениндинуклеотида на молекулы кислорода дискрет-ными этапами с чётко фиксированными окислительно-восстановитель-ными потенциалами. В этом процессе, связанном с прямым восстанов-лением молекулы кислорода четырьмя электронами, образуется вода.

Процессы переноса электронов на кислород находятся под строжай-шим ферментативным контролем, обеспечивающим полное восстановле-ние кислорода до воды или его включение в органические молекулы. Электронная конфигурация молекулы кислорода соответствует биради-калу и поэтому его восстановление до воды гораздо легче протекает по схеме последовательного присоединения, чем при согласованном переносе четырёх электронов. Последовательное одноэлектронное восстановление приводит к реакционноспособным промежуточным состояниям кисло-рода, которые в небольшом количестве всегда сопровождают течение нор-мального метаболизма:

При переносе на молекулу кислорода нечётного числа электронов образуются свободные радикалы, из которых самым реакционноспособ-ным является гидроксильный радикал. Он значительно легче реагирует с органическими молекулами, чем гораздо менее реакционноспособные пероксид и супероксид, при этом супероксид легко диспропорционирует на пероксид и кислород в присутствии супероксиддисмутазы:

Гидроксильный свободный радикал – это мощный и неизбирательный окислитель, реагирующий с органическими веществами, входящими в со-став клеток, с константами скорости порядка 110⁹-110¹⁰ моль^-1сек^-1. Вы-зываемое гидроксильным радикалом окисление представляет собой отрыв электрона от органической молекулы с образованием из неё свободного радикала, который с участием кислорода превращается в гидропероксид, генерируя при этом в цепной реакции множество новых свободных ради-калов, т.е. идёт реакция инициации и распространения цепи:

Обрыв цепи происходит в результате рекомбинации различных ради-калов в том числе и с образованием пероксидов, например ROOR.

Ярче всего цепные реакции окисления проявляются на липидных ком-понентах клеточных мембран, где объектом атаки свободных радикалов становятся метиленовые группы между двойными связями в остатках полиненасыщенных кислот:

Теперь образовавшийся пероксидный радикал отрывает атом водо-рода от другой метиленовой группы, превращается в гидропероксид и генерирует новый свободный радикал, который продолжает цепь свободно-радикальных превращений:

Накапливающиеся гидропероксиды окисляют другие ненасыщенные остатки по двойным связям. Одним из продуктов этого окисления стано-вится диальдегид малоновой кислоты, присутствие которого обнаружи-вается специальной цветной реакцией, позволяющей количественно опре-делять степень окислительного повреждения мембранных липидов:

Укороченные и гидрофилизированные окислительными превращени-ями остатки жирных кислот в составе мембранных липидов не могут боль-ше участвовать в поддержании структуры двухслойной мембраны и она лизируется, что приводит к гибели клетки.

Свободные радикалы сильно различаются по стабильности и реакци-онной способности. В частности, витамин Е и многие другие фенольные соединения с объёмными заместителями, принимая неспаренный электрон, делокализуют его в ароматической системе. Такие свободные радикалы не принимают участия в инициации и распространении цепи.

Продукты неполного восстановления молекул кислорода, органичес-кие пероксидные свободные радикалы и пероксидные соединения часто объединяют названием активный кислород. Кроме того, существует ещё так называемый синглетный кислород. При спонтанных изменениях спина электрона обычный триплетный кислород, который из-за несоответствия электронных характеристик молекул плохо реагирует с синглетными орга-ническими молекулами, переходит в синглетное состояние и становится более сильным окислителем. В процессе фотосинтеза образуется также триплетный хлорофилл, а обмен электронами между ним и триплетным кислородом приводит к появлению синглетного кислорода в возбуждён-ном состоянии, что делает его ещё более сильным окислителем. Для «гашения» триплетного хлорофилла и синглетного кислорода в состав мембран клеток растений входят каротиноиды, которые принимают в сис-тему сопряжённых связей электроны триплетного хлорофилла и синглет-ного кислорода и удерживают их до нового спонтанного изменения спина.

Объяснение токсичности кислорода образованием свободных радика-лов впервые было дано Гершманом (Gershman), который обратил внима-ние на подобие патологических изменений при гипероксии и рентгеновс-ком облучении. Основываясь на том, что при радиолизе водных растворов образуются свободные радикалы, он в 1954 г. сформулировал гипотезу о том, что кислородное отравление вызывается кислородными свободными радикалами. Он также дал этому явлению название гипероксидный стресс. Точно так же действие активного кислорода, каким бы ни был его источник, называют оксидативным стрессом.

Аэробные клетки подвергаются оксидативному стрессу даже при нор-мальном течении метаболических процессов. В клетках печени стационар-ная концентрация пероксида водорода определена равной 10^-9 моль/л. Со-держащийся в цитозоле пероксид водорода – это продукт диспропорцио-нирования супероксида, рассчитанная концентрация которого равна 10^‑12 моль/л. Внутриклеточный супероксид может быть образован в резуль-тате отклонений от нормального транспорта электронов в мембране мито-хондрий, например, так, как это постоянно идёт в эритроцитах при окис-лении двухвалентного железа в переносящем кислород гемоглобине (Hb), превращающегося при этом в метгемоглобин (metHb):

Это обеспечивает низкую, но постоянную скорость окисления неко-торых железосодержащих компонент электронпереносящей цепи. Тем не менее, самую высокую склонность к одноэлектронному окислению в этой цепи показывает восстановленный убихинон или пластохинон в клетках растений.

Метаболические или экологические отклонения от нормы могут про-воцировать повышенный уровень концентрации активного кислорода. При метаболических превращениях ксенобиотиков свободные радикалы обра-зуются в качестве основного или побочного продукта. Изучение токсичес-ких характеристик четырёххлористого углерода показало, что в основе его разрушительного действия на клетки печени лежит трихлорметильный радикал (CCl₃^), который образуется при метаболическом окислении четы-рёххлористого углерода цитохромом Р₄₅₀ или гемом с Fe²⁺:

Известно также, что хиноновые соединения переводят кислород в пероксид водорода. Хорошо известному токсическому действию прима-хина на эритроциты предшествует накопление в них пероксида водорода. Флавопротеины с участием NADPH и NADH катализируют восстанов-ление хинонов (Q) в свободнорадикальные семихиноны (HQ^), а семихи-ноны окисляются с образованием активного кислорода:

Окисление гидрохинонов (QH₂) также идёт с промежуточным образо-ванием семихинонов:

Токсичность хинонов объясняется как возможностью их превращения в органический свободный радикал, так и оксидативным стрессом в ре-зультате образования активного кислорода (возможность присоединения биомолекул по двойным связям хинонов здесь не рассматривается). Основ-ной механизм зависит от химической природы хинона и от реакционной способности семихинонов в их реакции с кислородом. Во всяком случае, некоторые хиноидные антибиотики с противораковой активностью прояв-ляют цитотоксичность через генерирование активного кислорода.

Активный кислород лежит в основе гербицидной активности и ток-сичности параквата и других дипиридилиевых солей (см. с. 178), которые превращаются в катионоидные свободные радикалы при переносе одного электрона, катализируемом ферредоксинами и NADРН-зависимыми мик-росомальными флавопротеинами. Катионрадикал параквата легко перено-сит свой неспаренный электрон на кислород с образованием супероксида, а сам возвращается в окисленную дикатионную форму. Непрерывный цикл окислительно-восстановительных превращений лежит в основе токсич-ности и гербицидной активности дипиридилиевых солей, проявляющейся в постоянном генерировании активного кислорода и полном исчерпании пула NADРН.

Стимулированные фагоцитные клетки (нейтрофилы) также генери-руют значительные количества супероксида в результате переноса одного электрона на кислород, катализируемого NADРН-зависимым ферментным комплексом, локализованным в плазматической мембране этих клеток. Образующиеся при этом супероксид и пероксид, как известно, отвечают за бактерицидное действие нейтрофилов и участвуют в течении воспалитель-ных процессов.

Многие ткани содержат ксантиндегидрогеназу (XD), которая катали-зирует окисление гипоксантина в ксантин и мочевую кислоту. Электроны этих субстратов переносятся на NADР⁺ с образованием NADРН. Иммуно-цитохимический анализ показал, что этот фермент находится в эндотелии сосудистой системы. Когда ток оксигенированной крови в сосудах какого-либо органа блокируется (ишемическая болезнь), ксантиндегидрогеназа подвергается частичному протеолизу и превращается в ксантиноксидазу (ХО). Теперь, несмотря на накопление субстрата, перенос электронов на NADР⁺ становится невозможным, так как ксантиноксидаза этот процесс уже не катализирует. Конечным акцептором становится кислород и опять образуются супероксид и пероксид. Постишемический поврежденный эндотелий сосудов, омываемый оксигенированной кровью, становится источником активного кислорода и повреждается им ещё больше.

Собственные защитные системы клеток, предназначенные для нейтра-лизации активного кислорода и включающие такие вещества, как витамин Е, аскорбиновая кислота, глютатион и другие восстановители, достаточно эффективно справляются с образованием свободных радикалов и перокси-дов при отсутствии соответствующих стрессов. Однако неблагоприятные условия окружающей среды и многие токсичные соединения вызывают усиленное образование этих окислителей и тогда собственных защитных сил организма может оказаться недостаточно.

В последнее время широкое распространение в качестве пищевых до-бавок и лекарственных средств получили натуральные вещества, ингиби-рующие течение свободнорадикальных реакций и окислительных превра-щений в организме человека. Более всего известны в этой области такие биофлавоноиды растительного происхождения, как рутин, кверцетин, дигидрокверцетин, эриодиктиол

Дигидрокверцитин Эриодиктиол

В растениях эти вещества содержатся в виде гликозидов, в частности, рутин – это гликозилированный остатками глюкозы и рамнозы по гидрок-сильной группе пиранонового цикла кверцетин. Он относится к группе витаминов Р (от англ. permeability – проницаемость). Эти вещества повы-шают эластичность кровеносных сосудов и снижают их проницаемость. Их рекомендуется принимать при различных заболеваниях, сопровождаю-щихся геморрагическими состояниями. Особенно эффективен рутин в сочетании с аскорбиновой кислотой (витаминный препарат аскорутин). Вместе эти вещества принимают участие в регуляции образования белка соединительной ткани коллагена и в окислительно-восстановительных превращениях.

По биологической активности к этой же группе соединений относятся и антоциановые красители, отвечающие за окраску многих цветов и пло-дов (шиповник, смородина, черноплодная рябина, черника). В растениях они также находятся в виде различных гликозидов. Соответствующие агликоны называют антоцианинами. В качестве примера приводится фор-мула цианидина:

Сравнение структур флавоноидов и антоцианинов показывает, что они способны к взаимопревращениям.

Полифенольные соединения, к которым относятся также представлен-ные выше витамины Р и антоциановые красители, широко распространены в растительном мире. Они обладают дубящим действием, основанным на денатурации белков, и поэтому растения используют их в качестве средств защиты от травоядных животных, насекомых и патогенных грибов. Вяжу-щий вкус во рту предупреждает, что денатурации подвергнутся и пищева-рительные ферменты, что сделает поедание растений и плодов с дубящими веществами совершенно бесполезным или даже опасным.

Ещё одно полифенольное соединение – ресвератрол (на него обратили внимание всего лишь несколько лет тому назад) обнаружено в шкурке виноградных ягод, где он выполняет роль фитоалексина – вещества с фун-гицидными свойствами, защищающего ягоды винограда от поражения плесневыми грибками:

Поскольку поражение патогенными грибами протекает обычно при влажных холодных погодных условиях, виноград, выращиваемый в регио-нах с более прохладным климатом, более обогащен этим биологически активным веществом.

Вероятнее всего именно ресвератрол (3,5,4-тригидрокси-транс-стильбен) лежит в основе так называемого «французского парадокса». Он состоит в том, что, несмотря на употребление жирной мясной пищи, французы реже страдают от сердечно-сосудистых заболеваний, чем другие европейцы. Это связывают с тем, что они чаще употребляют красное вино. Дело в том, что ресвератрол плохо растворим в воде и поэтому его очень мало в виноградном соке и в белом вине, которое получают сбраживанием виноградного сока. В отличие от этого технология приготовления красного вина основана на ферментации сока вместе со шкурками и косточками, и образующийся при этом спирт улучшает растворимость ресвератрола, а вместе с ним и придающих окраску вину антоциановых красителей.

Ресвератрол содержится во многих растениях, например, в эвкалипте, ели, в плодах шелковицы, в арахисе, но больше всего его в винных сортах винограда. Исследования показали, что ресвератрол является эффектив-ным антиоксидантом, средством для профилактики раковых заболеваний и соединением с эстрогенной активностью.