7.2. Окислительное декарбоксилирование пирувата
В аэробных условиях превращение пирувата идёт на пируватдегидро-геназном мультиферментном комплексе, работу которого обеспечивают три фермента: пируватдегидрогеназа (Е1), дигидролипоил-ацетилтранс-фераза (Е2) и дигидролипоил-дегидрогеназа (Е3), объединённые в частицы диаметром около 45 нм. Комплекс включает пять коферментов и просте-тических групп (тиаминпирофосфат, липоевая кислота, кофермент А, флавинадениндинуклеотид и никотинамидадениндинуклеотид). Из них только липоевая кислота образуется в организме животных из обычных метаболитов, тогда как тиамин (в тиаминпирофосфате), рибофлавин (в FAD), пантотеновая кислота (в коферменте А) и никотинамид (в NAD+) должны поступать в организм животных в виде витаминов.
Не нуждающийся в кислороде гликолиз идёт в цитозоле клетки, но основные аэробные биоэнергетические процессы протекают в матриксе митохондрий, отделённом от цитозоля двумя мембранами. Через внешнюю мембрану митохондрий легко проходят все вещества с молекулярной мас-сой до 10000, а для транспорта через внутреннюю мембрану существуют транспортные системы, одна из которых предназначена для переноса моле-кул пировиноградной кислоты.
Окислительное декарбоксилирование пирувата начинается с присо-единения его к тиаминпирофосфату так, как это было представлено выше для процесса спиртового брожения, но образовавшаяся после декарбокси-лирования пирувата 1‑гидроксиэтильная группа не отщепляется в виде альдегида, а переносится на один из атомов серы дитиоланового цикла липоевой кислоты в виде ацетата и атома водорода. Остаток липоевой кис-лоты присоединён к ферменту через аминогруппу лизинового фрагмента белковой молекулы (простетическая группа):
Декарбоксилированный тиамином остаток пировиноградной кислоты переносится на дитиолановый фрагмент по схеме:
Ацетилированный фрагмент дигидролипоилацетилтрансферазы маят-никовым движением отходит от тиаминпирофосфатного участка мульти-ферментного комплекса и отдаёт ацетильный остаток коферменту А:
Движение остатка дигидролипоевой кислоты после переноса ацетиль-ной группы на кофермент А завершается у дегидрогеназного участка муль-тиферментного комплекса, где атомы водорода двух сульфгидрильных групп переходят на флавинадениндинуклеотид и далее на никотинамид-адениндинуклеотид:
а образовавшийся в результате дегидрирования дитиолановый цикл воз-вращается к тиаминпирофосфатному участку для того, чтобы снова при-нять гидроксиэтильный остаток в виде ацетильной группы и атома водорода.
Процесс превращения пировиноградной кислоты в ацетилкофермент А необратим. При включении в обмен веществ меченного по углероду угольного ангидрида радиоактивная метка никогда не обнаруживается в пировиноградной кислоте.
7.3. Цикл Кребса
Последовательность превращений ацетильного остатка, образовавше-гося после декарбоксилирования пирувата, была открыта в 1937 г. немец-ким биохимиком Кребсом, эмигрировавшим в 1933 г. в Великобританию. Чаще всего это многостадийное циклическое превращение называют по имени открывшего его учёного, но можно также встретить такие названия, как цикл лимонной кислоты или цикл трикарбоновых кислот. Открытие цикла Кребса было отмечено Нобелевской премией 1953 года. Кребс разделил её с Липманном, открывшим аденозинтрифосфатный цикл.
В основу расшифровки биохимических превращений цикла Кребса легли наблюдения за обменными процессами в мышечных тканях. В них и раньше обнаруживали незначительные количества дикарбоновых кислот (янтарной, фумаровой, яблочной, щавелевоуксусной), а также трикарбоно-вых кислот (лимонной, цис-аконитовой, изолимонной). Добавки этих кислот к клеткам мышечной ткани вызывали заметное увеличение потреб-ления ими кислорода, а малоновая кислота останавливала течение аэроб-ных обменных процессов, вызывая в клетках накопление лимонной, кетоглутаровой и янтарной кислот. Кребс установил также, что инкубация мышечных клеток с пировиноградной и щавелевоуксусной кислотой приводит к росту концентрации в них лимонной кислоты. Эти наблюдения легли в основу представлений о циклическом пути превращений, в ходе которых на начальном этапе из щавелевоуксусной кислоты (анион оксало-ацетат) образуется лимонная кислота, а конечным продуктом превращений лимонной кислоты является щавелевоуксусная кислота, с которой этот процесс начинался.
На первой стадии цикла Кребса фермент цитратсинтаза катализирует образование лимонной кислоты (анион цитрат) из ацетилкофермента А и оксалоацетата по схеме:
В учебниках по биохимии принято представлять и называть кислоты как анионы, акцентируя этим внимание на то, что в живых клетках поддер-живается слабощелочная среда, но для лучшего понимания химизма про-цессов здесь и далее будут использоваться традиционные для химиков уравнения реакций. Суть представленной реакции состоит в том, что в тиоэфирах карбоновых кислот атомы водорода в -положении к карбо-нильной группе соответствуют по реакционной способности аналогичным атомам водорода в карбонильных соединениях. В соответствии с этим реакция образования лимонной кислоты подобна реакции альдольной конденсации. Первичным продуктом этой реакции является, конечно, цитроилкофермент А, но скорость его гидролиза выше скорости образова-ния и поэтому обнаружить его в клетках не удаётся.
После этого лимонная кислота при катализе цис-аконитазой превра-щается в изолимонную кислоту в результате обратимого отщепления и присоединения молекулы воды с образованием в качестве промежуточного продукта цис-аконитовой кислоты:
Цис-аконитаза – это металлопротеин с ионом железа Fe2+ в активном центре. Превращение цис-аконитовой кислоты в изолимонную идёт против правила Марковникова, и действительно в равновесном состоянии кон-центрация лимонной кислоты примерно на порядок превышает концент-рацию изолимонной, однако в дальнейшем превращении участвует только изолимонная кислота.
При дегидрировании изолимонной кислоты образуется трикарбоновая кетокислота, которая сразу декарбоксилируется и превращается в кето-глутаровую кислоту:
Далее ферментная система, аналогичная пируватдегидрогеназному мультиферментному комплексу, превращает кетоглутаровую кислоту в сукцинилкофермент А:
Тиоэфирная связь в этом соединении делает его макроэргическим, поэтому превращение сукцинилкофермента А в анион янтарной кислоты (сукцинат) сопровождается образованием другого макроэргического ве-щества, аналога аденозинтрифосфата – гуанозинтрифосфата (ГТФ, GTP):
Янтарная кислота дегидрируется FAD-зависимым ферментом с обра-зованием фумаровой кислоты, которая превращается в L-яблочную кисло-ту (анион малат) в результате гидратации фумаразой (см. с. 117):
И, наконец, NAD+-зависимый фермент L-малатдегидрогеназа перево-дит яблочную кислоту в оксалоацетат, с реакции которого с ацетилкофер-ментом А начиналась эта цепочка превращений:
Роль щавелевоуксусной кислоты в биохимии не ограничивается учас-тием в цикле Кребса. Она может быть предшественником аспарагиновой кислоты и аспарагина (правда, она может быть также получена из этих аминокислот). Для иных обменных процессов из цикла Кребса могут изыматься и другие его участники, например, кетоглутаровая кислота для образования глютаминовой кислоты и глютамина. Кроме того, щавелево-уксусная кислота – это исходный продукт для образования глюкозы при недостатке её в пище. Не исключены также просто сбои в системе транс-порта и превращений участвующих в цикле Кребса веществ, которые при-водят к потере оксалоацетата. Поэтому должен существовать автономный механизм образования оксалоацетата. Этот биохимический процесс отно-сится к анаболическим, но он является неотъемлемой частью цикла Кребса и поэтому есть смысл рассмотреть его в этом разделе.
Процессы, в которых образуются промежуточные продукты многоста-дийных биохимических превращений, в общем случае называют анаплеро-зом. Исходным продуктом для образования оксалоацетата является пиру-ват, который карбоксилируется бикарбонатным анионом с участием адено-зинтрифосфата в каталитическом центре соответствующей карбоксилазы. Положительным эффектором этого фермента служит ацетилкофермент А, то есть при отсутствии в клетках свободного ацетилкофермента А биосин-тез оксалоацетата из пирувата не идёт. Механизм кабоксилирования биотинзависимыми ферментами рассматривался выше (см. стр. 108).
В данном случае гетероциклический структурный элемент биотина, несущий карбоксилатную группу, перемещается в другой участок катали-тического центра и там отдает её пирувату с образованием оксалоацетата:
