9. Фотосинтез

Фотосинтез – это основной анаболический процесс, основанный на ассимиляции диоксида углерода с образованием углеводов, протекающий на свету во всех содержащих хлорофилл клетках. В катаболических окис-лительных превращениях и при горении углеводов образуются диоксид углерода и вода, выделяется энергия и потребляется кислород. Из этого следует, что обратный процесс может протекать только с затратой энергии (её то и поставляет поглощаемый хлорофиллами свет) и с участием восста-новительного потенциала. Поскольку в природе водород находится в виде протонов, восстановление диоксида углерода должно сопровождаться переносом электронов от какого-либо донора (Х^Θ):

Интенсивность фотосинтеза зависит от температуры и поэтому все проте-кающие при этом реакции не могут быть чисто фотохимическими. Это подтверждается и тем, что ассимиляция диоксида углерода некоторое время продолжается и после переноса растения в темноту. Понятно также, что энергия света должна быть трансформирована в обычный для живых клеток источник химической энергии, которым может быть только АТФ. Поскольку окислительно-восстановительный потенциал системы глюкоза-кислород/вода-диоксид углерода равен примерно -0,4 В, участвующий в превращении СО₂ в углеводы восстановитель должен иметь более сильный восстановительный потенциал. В этой роли выступает NADPH с восстано-вительным потенциалом около ‑0,45 В. Эти общие рассуждения приводят к следующим выводам:

1. Превращение диоксида углерода в углеводы требует восстановитель-ного потенциала и АТФ.

2. Свет нужен только для образования в клетке аденозинтрифосфата и NADPH.

3. При наличии в клетке АТФ и NADPH превращение диоксида углеро-да в углеводы может идти и без света (правда это не совсем верно, так как некоторые участвующие в ассимиляции ферменты активируются светом).

Организмы, использующие в качестве источника энергии свет, очень разнообразны, а масштабы фотосинтеза можно проиллюстрировать тем, что весь кислород атмосферы Земли имеет биогенное происхождение. В настоящее время около половины всего кислорода поступает из воды в результате жизнедеятельности водорослей и фитопланктона. В раститель-ных клетках фотосинтез протекает в органеллах, которые называются хло-ропластами. Во внутренней среде (строме) хлоропластов, отделенной от цитозоля двойной мембраной, находятся плоские тилакоиды, стопки из которых образуют граны, все тилакоиды соединены протоками.

В мембране тилакоидов содержатся ферменты, транспортные белки и электронпереносящие пигменты. Одним из ферментов в мембране тила-коидов является АТФ-синтетаза, она аналогична АТФ-синтетазе мито-хондрий, работа которой представлена на с. 166-168. Фиксация диоксида углерода идёт в строме с участием соответствующих ферментов. Имеется определённое подобие хлоропластов и митохондрий, но набор транслоказ и ферментов в хлоропластах значительно беднее, поскольку в растениях основные катаболические превращения также протекают в митохондриях. Строение хлоропласта представлено на рисунке:

Для поглощения энергии света в фотосинтезирующих клетках содер-жатся хлорофиллы – магнийпорфирины зелёного цвета:

В число вспомогательных пигментов входят каротиноиды, защищаю-щие молекулы хлорофиллов от повреждения активированным кислородом:

-Каротин

Плоская металлопорфириновая структура хлорофилла фиксирована и определённым образом ориентирована в мембране тилакоида липофиль-ным фрагментом сесквитерпенового спирта фитола, связанного эфирной связью с карбоксильной группой в молекуле хлорофилла.

Циклическая система сопряжённых двойных связей позволяет моле-кулам хлорофиллов поглощать в видимой области спектра широкие поло-сы с длинами волн около 450 нм (синий цвет) и около 650-700 нм (крас-ный). Поглощение света сопровождается переходом электронов на орби-тали с более высокой энергией. Так, поглощение "красного" фотона соот-ветствует переходу электрона на первый энергетический уровень, "синего" – на второй. При этом составляющие пару электроны находятся в синглетных состояниях S₀, S₁ и S₂ (нулевой, первый и второй уровни), сохраняя антипараллельность спинов.

В молекулах с большим числом сопряженных двойных связей p‑элек-троны делокализованы, и для них становится возможным нахождение на нескольких подуровнях с энергиями выше и ниже основного p-p*-перехо-да изолированной двойной связи. На каждом из возбуждённых состояний возможен безизлучательный переход возбуждённого электрона (экситона) на более низкие подуровни с потерей энергии в виде тепла при соударе-ниях с другими молекулами. Этот процесс называется колебательной ре-лаксацией. Возможен также безизлучательный переход электрона с орби-тали S₂ на орбиталь S₁ в результате внутренней конверсии, если у под-уровня с низкой энергией орбитали S₂ есть энергетический (частотный) эквивалент на одном из высоких подуровней орбитали S₁. Возврат на нулевой уровень протекает с излучением кванта света (флуоресценция) через несколько нано- или даже микросекунд после его поглощения.

При спонтанных обращениях спинов возбуждённых электронов воз-вращение на нулевой уровень становится невозможным из-за того, что оба электрона пары получают параллельные спины. Такие возбуждённые со-стояния, называемые триплетными (Т₁, Т₂), могут обмениваться электро-нами с молекулой кислорода, оба атома которой находятся в триплетном состоянии, и тогда образуется синглетный кислород, который обладает повышенной реакционной способностью по отношению к органическим веществам. Для нейтрализации (гашения) триплетного состояния хлоро-филла и синглетного состояния кислорода в состав пигментов мембран тилакоидов входят каротиноиды. Излучательный возврат возбуждённого триплетного состояния хлорофилла в невозбуждённое синглетное возмо-жен только после повторного обращения спина экситона. Это обычно рас-тянуто во времени, и такое свечение называют фосфоресценцией. Незави-симо от длины волны поглощаемого света хлорофилл флуоресцирует и фосфоресцирует только в красном свете.

Цвет листа растения определяется соотношением пигментов в мем-бранах тилакоидов. Он может меняться от сине-зелёного у ели до тёмно-бурого у некоторых декоративных растений и водорослей, но зелёные хло-рофиллы обязательны для всех фотосинтезирующих биохимических сис-тем. Все пигментные молекулы фотосистем поглощают свет и могут обме-ниваться экситонами, но на группу из примерно 200 молекул хлорофилла и 50 молекул каротиноидов есть одна пара молекул хлорофилла, связанных в комплекс с белком. Этот хлорофилл лежит в начале электронпереносящей цепи пигментов, превращающих световую энергию в химическую. В отличие от интегрированных в мембрану молекул хлорофилла, называе-мых антенными, комплекс хлорофилла и белка называют фотохимичес-ким реакционным центром или фотореакционным центром.

Передача возбуждённого электрона (экситона) от одной молекулы к другой происходит в области перекрывания электронных облаков моле-кул, когда экситон переходит в электронное облако другой молекулы, а его место занимает S₀ электрон этой молекулы. Возбужденные электроны передаются от одной молекулы антенного хлорофилла к другой до тех пор, пока не оказываются в молекуле хлорофилла фотореакционного центра. Отсюда начинается их путь по пигментам мембраны тилакоидов для совершения работы по синтезу АТФ и восстановительного потенциала. Тилакоидные мембраны высших растений содержат фотосистемы двух типов со своим набором антенных молекул и фотохимическими реакцион-ными центрами. Фотосистема I (ФС I) поглощает свет в более длинновол-новой области (около 700 нм), и при облучении изолированных хлороплас-тов монохроматическим светом с этой длиной волны генерируется восста-новительный потенциал при невысокой скорости образования кислорода и биосинтеза АТФ. Основная полоса поглощения хлорофиллов фотосистемы II (ФС II) лежит в области 680 нм, и облучение хлоропластов только таким светом приводит к усилению синтеза АТФ с выделением кислорода. Существуют также микроорганизмы, в клетках которых фотосинтез не сопровождается генерированием кислорода. Их мембраны содержат только компоненты фотосистемы I.

Фотосинтезирующие микроорганизмы, обитающие в восстановитель-ных средах, передают электроны возбужденного состояния хлорофилла на NADP⁺, а образовавшийся дефицит электронов восполняет донор, прини-мающий их от субстратов восстановителей (органические вещества, серо-водород или др.). Однако подавляющее большинство растений и исполь-зующих энергию света одноклеточных микроорганизмов находятся в условиях, где источники легкодоступных электронов отсутствуют, и они вынуждены с большой затратой энергии отбирать их у воды – вещества, которое в большем или меньшем количестве присутствует повсеместно. В процессе эволюции живого у таких автотрофных клеток возникла допол-нительная фотосистема – ФС II, которая за счёт лучистой энергии приоб-ретает способность окислять кислород воды. В результате согласованной работы ФС I и ФС II в мембранах хлоропластов возникает ток электронов от воды к NADP⁺ через цепь пигментов. В фотосистеме II антенные моле-кулы хлорофилла передают возбуждённые электроны на фотореакцион-ный центр, от которого они поступают на пластохинон (он аналогичен убихинону в мембранах митохондрий):

затем на цитохромы b и f (сyt b, сyt f) и далее через пластоцианин на фото-реакционный центр ФС I. Молекулы хлорофилла в фотохимическом реак-ционном центре ФС II после передачи возбуждённых электронов молеку-лам пластохинона превращаются в ионрадикалы (P₆₈₀^+), которые получа-ют электроны от молекул воды через окислительно-восстановительную систему, основанную на металлопротеине, в состав которого входит ион марганца Mn²⁺. Фотореакционный центр ФС I, представляющий собой белково-хлорофилловый пигмент (P₇₀₀), отдаёт электроны ферредоксину – металлопротеину с атомами железа в окружении сульфидных групп. Эти посредники с помощью фермента ферредоксин-NADP⁺-оксидоредуктазы восстанавливают никотинамидадениндинуклеотидфосфат:

Энергия электронов в ФС II используется также для создания гради-ента концентраций ионов водорода с подкислением (рН около 4,0) внут-ренней среды тилакоидов, т.е. градиент концентраций создаётся между внутритилакоидным пространством и стромой. Как и в окислительном фосфорилировании протоны проходят через АТФ-синтетазу, но в этом случае её выступающаяся из мембраны субъединица F₁ направлена в сторону стромы. Комплекс из ФС I и ФС II работает достаточно гибко. Если нет необходимости в восстановительном потенциале (весь NADP⁺ превратился в NADPH), то электрон от ФС II не поступает в цепь переноса электронов ФС I, а возвращается на пигменты ФС II и в циклическом про-цессе продолжает участвовать в создании градиента концентрации прото-нов, обеспечивая работу АТФ-синтетазы. Механизм переноса протонов здесь аналогичен тому, который рассматривался при изучении окислитель-ного фосфорилирования (с. 162-164). Здесь также определённую роль играет вода, но если при окислительном фосфорилировании перенос элек-тронов на молекулу кислорода приводил к связыванию четырёх протонов с образованием воды, то в фотосинтезе при окислении молекулы воды остаются два протона. В соответствии с этим ферментная система, окис-ляющая воду и генерирующая кислород, расположена на внутренней сто-роне мембраны тилакоида и подкисляет его внутреннее пространство.

В 1937 г. в Кембридже Р. Хилл показал, что выделение кислорода и восстановление диоксида углерода не связаны в единый процесс. Он облу-чал светом суспензию хлоропластов, выделенных из растительных клеток, в растворе синего красителя, восстановленная форма которого бесцветна. При этом оказалось, что сопровождающееся выделением кислорода обес-цвечивание красителя идёт только на свету, и роль лучистой энергии сво-дится таким образом к индукции переноса электронов от кислорода воды к акцептору по уравнению:

Сейчас это уравнение в общем виде называют реакцией Хилла, а А – реагентом Хилла. Интенсивность этого упрощённого варианта фотосинте-за легко определяется спектрофотометрически по изменению оптической плотности раствора красителя, и поэтому реакцию Хилла часто исполь-зуют для оценки биологической активности гербицидов, механизм дейст-вия которых направлен на ингибирование фотосинтеза. В стандартных условиях можно сравнивать различные фитоактивные вещества без учёта факторов детоксикации, активации или транспорта в многоклеточном растении. В хлоропластах роль реагента Хилла выполняет NADP⁺.

Многоступенчатый путь окислительно-восстановительных превраще-ний пигментов в мембранах хлоропластов очень уязвим. Многие вещества могут вмешиваться в этот процесс, блокируя перенос электронов от одного члена цепи к другому. В частности, мочевинные и триазиновые гербициды – диурон (1), симазин (2):

связываются с регуляторным центром белково-хлорофиллового комплекса ФС II и останавливают перенос электронов на пластохинон. Тогда возбуж-дённые электроны переходят на кислород, и превращают его в сильней-ший окислитель ионрадикал супероксид – О₂^–•, который вызывает окисли-тельную деструкцию липидных составляющих клеточных мембран и ги-бель растения.

Действие дипиридиллиевых солей основано на вмешательстве в функ-ционирование ФС I. Такие вещества, как паракват, очень близки по потен-циалу восстановления к NADP⁺ и, конкурируя с ним в активном центре ферредоксин-NADP⁺-оксидоредуктазы, принимают электроны, превраща-ясь в сравнительно устойчивые окрашенные свободные радикалы (на схеме приведена одна из шести возможных мезомерных структур):

Образовавшийся свободный радикал (у параквата он окрашен в фио-летовый цвет) отдаёт неспаренный электрон кислороду, возвращается в исходное состояние и может снова принимать электрон в ФС I:

Превратившаяся в супероксид молекула кислорода запускает цепь окислительных превращений в растительных клетках, приводя их к гибели.

Каким же образом идёт фиксация диоксида углерода при фотосинте-зе? Опыты с меченным по углероду CO₂ показали, что у большинства рас-тений первым соединением с радиоактивной меткой оказывается 3-фос-фоглицерат и лишь потом это соединение превращается в другие вещества с большим или меньшим количеством атомов углерода. Было установлено, что образование 3-фосфоглицерата протекает с помощью фермента рибу-лозодифосфаткарбоксилазы, локализованной на поверхности тилакоид-ных мембран. Этот самый распространённый фермент биосферы имеет молекулярную массу около 550000, и в его состав входят 8 каталитических и 8 регуляторных субъединиц. Химизм процесса представляется следую-щим образом: енольная форма 1,5-дифосфорибулозы образует стабильный нуклеофильный анион, который при ферментативном катализе реагирует с диоксидом углерода с образованием аниона фосфорилированной ‑кето-кислоты, разлагающейся водой с разрывом C-C-связи между вторым и третьим углеродным атомами углеродного скелете рибулозы:

Дальнейшие превращения молекул фосфоглицерата описываются циклом Кальвина. Двенадцать молекул фосфоглицерата, образовавшихся в результате присоединения шести молекул диоксида углерода к шести мо-лекулам дифосфорибулозы, фосфорилируются АТФ по карбоксильной группе и восстанавливаются действием NADPH до фосфоглицеринового альдегида. После этого пять молекул фосфоглицеринового альдегида изо-меризуются в фосфат диоксиацетона. По реакции, обратной начальному этапу гликолиза из трёх молекул фосфоглицеринового альдегида и трёх молекул фосфата диоксиацетона образуются три молекулы 6-фосфофрук-тозы. Одна молекула 6-фосфофруктозы выводится из цикла и включается в обычные метаболические процессы (например, идёт на биосинтез крах-мала), а две оставшихся реагируют с двумя молекулами 3-фосфоглицери-нового альдегида по схеме:

Эта катализизируемая транскетолазой реакция приводит к образова-нию эритрозо-4-фосфата и ксилулозо-5-фосфата. Две молекулы эритрозо-4-фосфата и две молекулы фосфата диоксиацетона при катализе альдола-зой реагируют с образованием двух молекул соответствующей дифосфо-гептулозы, гидролизующейся до 7-фосфоседогептулозы. Теперь две моле-кулы 7-фосфоседогептулозы и две молекулы фосфоглицеринового альде-гида при катализе транскетолазой по аналогии с приведённой выше схемой превращаются в две молекулы 5-фосфорибулозы и две молекулы 5-фос-фоксилулозы, а четыре молекулы 5-фосфоксилулозы (две из этой и две из предыдущей реакции) при катализе соответствующей эпимеразой также превращаются в 5-фосфорибулозу. В общем виде это представляется схемой:

Все эти превращения относятся к реакциям, для протекания которых свет уже не нужен, они идут за счёт накопленных в процессе фотосинтеза аденозинтрифосфата и NADPH и называются поэтому темновыми реакци-ями. Аллостерическим ферментом в реакции фиксации диоксида углерода является рибулозодифосфаткарбоксилаза. Ее положительными эффектора-ми являются ионы магния, протоны и NADPH, а это означает, что несмот-ря на кажущуюся независимость от света процесс фиксации CO₂ с макси-мальной скоростью идёт только на свету, так как повышение кислотности внутритилакоидного пространства и накопление восстановительного потенциала непосредственно связаны с поглощением света пигментами мембраны тилакоида.

К числу темновых реакций относится и дыхание растений – комплекс окислительных превращений образовавшихся в ходе фотосинтеза веществ. Но есть и световое дыхание, при котором образуется фосфогликолят. Оказалось, что рибулозодифосфаткарбоксилаза может катализировать также взаимодействие рибулозодифосфата с кислородом, в ходе которого образуется фосфоглицерат и фосфогликолят:

В солнечный безветренный день концентрация диоксида углерода в припочвенных слоях воздуха резко снижается за счёт фиксации его расте-ниями, и тогда с дифосфатом рибулозы вместо диоксида углерода начина-ет реагировать кислород. Образовавшаяся при этом фосфогликолевая кис-лота не может ассимилироваться в углеводы, и её дальнейшее превраще-ние идёт по катаболическому пути. В результате светового дыхания при казалось бы благоприятных погодных условиях растения не накапливают биомассу и могут её даже терять. В условиях жаркого климата очень часто максимальная инсоляция совпадает с безветренной погодой, поэтому мно-гие южные растения используют вспомогательный путь фиксации диокси-да углерода, когда первичным продуктом, в который ассимилируется диоксид углерода, является щавелевоуксусная кислота. Осуществляющий этот процесс фермент не переключается на работу с кислородом. После этого в растительных клетках оксалоацетат декарбоксилируется и выде-ляющийся диоксид углерода создаёт достаточно высокую локальную кон-центрацию в клетках растения, обеспечивая эффективную работу рибуло-зодифосфаткарбоксилазы и протекание цикла Кальвина. В отличие от С₃‑растений, у которых первичным продуктом присоединения СО₂ явля-ется фосфоглицерат, такие растения называют С₄-растениями (в молекуле оксалоацетата четыре атома углерода). К ним относятся, например, кукур-уза, сахарный тростник и просо.