2.6. Трансмембранный электрохимический протонный градиент и его составляющие.

Состояние вещества s в растворе можно охарактеризовать через химический потенциал _s , который измеряется в единицах свободной энергии. При условии, что активность вещества равна его концентрации, и что гидростатическим давлением* можно пренебречь, химический потенциал s равен:

_s _os  RT ln C_s (Джмоль^1-)

Где _os - стандартный химический потенциал при концентрации вещества 1М;

C_s - молярная концентрация вещества s;

Состояние иона i определяют через электрохимический потенциал , который учитывает тот факт, что состояние иона зависит не только от его концентрации, но и от электрического потенциала раствора:

 _i _io  RT ln C_i zF Джмоль ^-1

_oi - стандартный электрохимический потенциал при концентрации иона 1М;

R - газовая постоянная (8,314 Джмоль^-1 К^-1);

Т – абсолютная температура, К⁰;

[C_i] – концентрация иона в молях;

F - число Фарадея ( 96500 кулонов или 96,4 Дж В^-1 моль^-1);

z - заряд иона;

 - электрический потенциал раствора;

*В главе “Водный обмен” будет показано, что химический потенциал воды зависит не только от активности воды, но и от гидростатического давления в системе;

Электрохимический потенциал оценивать свободную энергию иона и учитывает все силы, способные побудить ион к движению из одной области в другую. Спонтанное движение ионов через мембрану из области с более высоким в область с более низким электрохимическим потенциалом представляет собой пассивный транспорт, или диффузию. Движущей силой диффузии является разность электрохимических потенциалов, или трансмембранный электрохимический градиент иона _i Движение иона против градиента электрохимического потенциала требует энергии и называется активным транспортом. Если потенциалы ионов по обе стороны мембраны равны, т.е. _i равен нулю, это означает, что ионные потоки через мембрану находятся в равновесии.

Представим, что мембрана разделяет две области, в которых содержание ионов Н⁺ разное и электрохимические потенциалы Н⁺ соответственно равны

Н⁺ ₁ и Н⁺ ₂

Сторона 1 : H⁺₁ = Н⁺₀  2,3RT lg Н⁺₁nF₁.

Сторона 2 : H⁺₂ =  Н⁺₀  2,3RT lg Н⁺₂ nF₂.

H⁺₁ H⁺₂

Н ⁺ Н⁺ Н⁺ Н⁺ Н⁺ Н⁺

Н⁺ ОН^- Н⁺ Н⁺

Н⁺ ОН^- ОН^- ОН^- ОН^-

Н⁺ Н⁺ ОН^- ОН^-

Н⁺ Н⁺ Н⁺ Н⁺ ОН^- ОН^-

В результате неравномерного распределения иона Н⁺ возникает трансмембранный градиент электрохимического потенциала ⁺, равный разности электрохимических потенциалов протонов по обе стороны мембраны:

H⁺₁ - H⁺₂ = ⁺ zF_1-2  RTln [H⁺]_1/ ⁺₂ (Джмоль^-1)

⁺ - разность электрохимических потенциалов иона H⁺по обе стороны мембраны;

z - заряд иона Н⁺, равный +1;

_1-2 - разность электрических потенциалов между двумя водными фазами, разделенными мембраной, т.е. электрический потенциал на мембране в вольтах;

[H⁺]₁ и [H⁺]₂ - молярные концентрации ионов Н⁺ по обе стороны мембраны; индексы 1 и 2 относятся к растворам, находящимся внутри и снаружи замкнутой мембраны;

Частное от деления величины ⁺ на постоянную F называется протондвижущей силой  и измеряется в вольтах. Если ввести константы и выразить логарифм концентраций ионов Н⁺ в единицах рН ( рН= log ⁺ , то для температуры в 25 ⁰ С получим простое выражение:

/F =  59 (мB)

Как видно из уравнения, протондвижущая сила состоит из двух компонентов. Это градиент  , разность концентраций ионов Н⁺ по обе стороны мембраны. Градиент рН заставляет ионы Н⁺ и ОН^- концентрироваться около поверхности мембраны. Это приводит к возникновению мембранного потенциала , созданного избытком положительного заряда на одной стороне мембраны и отрицательного – на другой. Эффект мембранного потенциала усиливается другими ионами разных знаков, которые также притягиваются и концентрируются около мембраны. Следует подчеркнуть, что, хотя одна стороны мембраны заряжена более положительно по отношению к другой, основой раствор остается в целом электронейтральным, т.е. содержит равное число катионов и анионов. Дело в том, что число «лишних», несбалансированных ионов, формирующих слой заряда на мембране, ничтожно мало в сравнении с общим числом ионов в растворе.

2.7. Энергия ⁺ используется для синтеза АТФ из АДФ и Фн при участии АТФ-синтазы.

Неравномерное распределение протонов по обе стороны мембраны побуждает их к диффузии по градиенту концентрации и заряда, которой препятствует мембрана. Энергия ⁺, или  является мерой свободной энергии( G = ⁺), которая запасена на мембране и может быть освобождена, если протоны начнут проходить мембрану по градиенту своего потенциала. Эта энергия может быть использована, если есть механизм сопряжения диффузии с энергозависимой реакцией. Такой механизм представляет собой АТФ-синтаза ( F₁F₀ АТФаза, или Н⁺АТФ-аза F – типа), интегрированный в сопрягающую мембрану ферментный комплекс, который использует энергию ⁺ для синтеза АТФ из АДФ и Фн. Синтез сопряжен с обратным током протонов по градиенту своего потенциала через АТФ-синтазный комплекс, т.е.осуществляется в момент разрядки мембраны при уменьшении, или диссипации ⁺.

Обе составляющие ⁺– градиент  рН и мембранный потенциал  - стремятся заставить протоны пересекать мембрану по градиенту концентрации или заряда, и обе составляющие, таким образом, равноценны для синтеза АТФ. Этот тезис подтверждается в экспериментах in vitro. АТФ- синтазы могут быть выделены из мембраны с помощью детергентов и встроены в искусственные мембранные пузырьки (липосомы), приготовленные из очищенных фосфолипидов. В этом случае синтез АТФ можно наблюдать, если искусственно создать градиент рН, или приложить к мембране разность электрических потенциалов.

Хотя основная функция АТФ-синтазы - синтез АТФ, этот фермент в определенных условиях может проявлять АТФазную активность, т.е. перекачивать протоны против градиента за счет гидролиза АТФ. Следовательно, АТФ синтаза ( Н⁺АТФаза) в принципе способна в взаимопревращению двух форм энергии:

АТФ-синтаза

⁺ АТФ

АТФаза

Энергия ⁺ может быть использована не только для синтеза АТФ, но и в других целях. Например, в митохондриях ⁺ используется для транспорта веществ через мембрану. Кроме того, рассеивание ⁺ имеет значение в терморегуляторном образовании теплоты (см. раздел «дыхание»).

2.8. Синтез АТФ связан с конформационными изменениями активных центров АТФ-синтазы (Н⁺АТФазы F - типа). Ротационный механизм действия фермента.

АТФ- синтазы разного происхождения, из митохондрий, хлоропластов или бактериальных мембран, имеют в целом схожее строение, что говорит о несомненно древнем эволюционном происхождении фермента. На снимках, полученных при помощи электронной микроскопии, АТФ-синтазы выглядят как локализованные в мембранах грибовидные структуры. Хорошо видно, что фермент состоит из двух частей, двух белковых комплексов, которые обозначают как фактор F₁ и фактор F₀ (CF₁и СF₀ -для АТФ синтазы хлоропластов). F₁ фактор, или комплекс расположен вне мембраны и на снимках представляет собой “шляпку” гриба высотой 80Å и шириной 100 Å Этот гидрофильный сферический комплекс представляет собой каталитический центр, на котором осуществляется синтез АТФ. Гидрофобный F₀- фактор интегрально встроен в мембрану и формирует канал, по которому ионы Н⁺ могут пересекать мембрану, двигаясь по градиенту своего потенциала. Более детально структура фермента была исследована с помощью ренгеноструктурного анализа с разрешением 2,8 Å на комплексах, выделенных из митохондрий сердца быка и мембран E. coli. (Рис.2.2.)

Комплекс F₁ состоит из пяти разных субъединиц в соотношении ₃ ₃    . Основу его структуры составляют гомологичные  и  субъединицы, чередующиеся друг с другом. Места связывания для нуклеотидов расположены как на , так и на  субъединицах, но активные центры, где происходит синтез АТФ, расположены только на  субъединицах.  и  субъединицы поочередно расположены вокруг  субъединицы, которая представляет собой стержень ( 90 Å) и, как втулка, проходит через каталитический центр, связывая F₁ и F₀ факторы. Субъединица , расположенная на внешней стороне одной из  субъединиц, служит сайтом прикрепления двух b субъединиц, которые заякоривают F₁комплекс в мембране. Функции  -субъединицы связаны, видимо, с регуляцией. Фактор F₁ легко диссоциирует от F₀ и in vitro проявляет АТФазую активность, гидролизуя АТФ.

Комплекс F₀ состоит из трех типов белковых субъединиц в соотношении a₁ b₂ с_9-12 и обеспечивает связывание F₁ c мембраной и перенос протона. Небольшие, очень гидрофобные с-субъединицы, имеющие по два трансмембранных участка, формируют проводящий протоны канал, который обеспечивает прохождение Н⁺ через всю мембрану. Интересно отметить, что такой сложный ферментный комплекс как АТФаза находится под двойным генетическим контролем: три субъединицы F₀-фактора и  субъединицы фактора F₁ кодируются геномом митохондрий или хлоропластов, тогда как синтез остальных субъединиц контролируется ядерными генами.

Исследования АТФ синтазных комплексов велись давно, но механизм их действия и структурно-функциональная связь F₁ и F₀ факторов стали понятными относительно недавно. Здесь следует отметить приоритет работ P. Boyer и J. Walker ( Нобелевская премия 1997). Благодаря исследованиям этих ученых стал понятным принцип работы фермента, получивший название ротационного механизма. Согласно ротационному механизму энергия, освобождаемая при диффузии протонов через F₀-канал используется для вращения  -субъединицы. Результатом ротации - субъединицы является последовательная смена конформационных состояний активных центров, расположенных на трех  субъединицах F₁ комплекса. Синтез АТФ из АДФ и Фн идет в активных центрах спонтанно, благодаря конформационным перестройкам. Энергия ⁺, освобождаемая в результате протонного транспорта через F₀- канал, тратиться не на синтез АТФ, а необходима для освобождения АТФ из активных центров в результате изменения его конформации. Прямое доказательство ротационного механизма было получено японскими учеными, которым удалось продемонстрировать вращение  -субъединицы относительно сидящего на ней фактора F₁. Изолированный комплекс F₁ был иммобилизован на неподвижной подложке, а к концу  субъединицы был химически пришит флуоресцирующий фрагмент нити актина длиной 1 микрон. С помощью флуоресцентного микроскопа в реальном времени удалось наблюдать вращение нити актина при работе фермента, гидролизующего АТФ. Таким образом, в механических терминах АТФ- синтазу можно сравнить с молекулярным мотором. Фактор F₁ и мембранный якорь в виде двух b и одной  субъединиц выступают как стационарный корпус, в котором  субъединица, а возможно и F₀ фактор в целом, выполняют функцию вращающегося ротора. Движущей силой вращения этого молекулярного мотора является ток Н⁺, которой вызывает определенное вращение с- субъединиц в результате последовательного протонирования \ депротонирования функционально важных аминокислотных остатков в составе канала. Показано, что в транспорте протонов особая роль принадлежит конкретным остаткам аргинина, глутамата, аспарагина и тирозина. Расчеты показывают, что синтез одной молекулы АТФ сопряжен с транспортом 3-4Н⁺ через F₀ -канал.

Рассмотрим подробно, в результате каких событий происходит синтез АТФ в каталитическом центре фермента. Согласно последним данным ( P. Boyer, 2000), в результате вращения - субъединицы относительно F₁-фактора изменяется состояние расположенных на  -субъединицах трех активных центров, каждый из которых может поочередно находится в трех разных конформациях (рис.2.3 ). Эти конформационные состояния получили называния «открытого» (open, O), «закрытого» ( tight, T) и «слабосвязанного», или «неплотного» (loose, L) центров и различаются по степени сродства к АДФ, АТФ и Фн. Принципиальным моментом является тот факт, что в результате тесного контакта между ,  и  субъединицами, конформационные изменения возникают одновременно на всех трех - субъединицах при повороте  субъединицы на 120⁰. При этом каждый активный центр последовательно проходит через три смены конформаций и возвращается в исходное состояние при полном повороте -субъединицы на 360⁰(рис.2.3). Каталитический цикл начинается со связывания АДФ и Фн в О-центре: в «открытом» состоянии центр имеет высокое сродство к АДФ и крайне низкое – к АТФ. В то же время АДФ и Фн относительно слабо удерживаются в центре и могут выходить из него. Поворот - субъединицы на 120⁰ переводит О -центр в «закрытое», Т -состояние. В Т-центре молекулы АДФ и Фн уже прочно связаны и не могут его покинуть. Конформация Т-центра такова, что в нем самопроизвольно идут акты образования и разрыва ковалентной связи АДФФн, т.е. синтеза и гидролиза АТФ. Важно, что синтез АТФ в «закрытом» центре идет спонтанно, энергетически даром, только за счет создания особой конфигурации между активными группами фермента и молекулами АДФ и Фн. Более того, синтез АТФ в «закрытом» центре может идти даже в условиях деэнергезованной мембраны, или даже вне мембраны на изолированном F₁ комплексе. Однако освобождения синтезированной АТФ из «закрытого» центра не происходит – для этого необходим следующий этап вращения и переход в состояние L-центра. В этом состоянии связи АТФ с центром ослабевают, и молекула может его покинуть и перейти в водную фазу. Важно отметить, что в момент открытия Т- центра в нем находится именно молекула АТФ. Предполагается, что в момент перехода равновесие АДФ+Фн↔АТФ сдвигается в сторону синтеза АТФ под влиянием протондвижущей силы. Следующий этап вращения переводит центр в исходное «открытое» состояние, из которого, вероятно, также возможен выход АТФ. Таким образом, в течение синтеза АТФ конформационные состояния активных центров последовательно меняются в направлении:

OT LO

В условиях, неблагоприятных для синтеза АТФ, например при низком содержании АДФ или Фн, или при низкой p, может происходить гидролиз АТФ и перекачка протонов против градиента. В этом случае происходит связывание АТФ в L - центре и гидролиз АТФ, сопряженный с последовательной сменой конформаций в обратном направлении LTO .

В настоящее время все аспекты работы АТФ-синтазы являются предметом интенсивного изучения. Аминокислотные остатки и функциональные группы, критичные для вращения и для конформационных изменений, исследуются с помощью точечного мутагенеза, позволяющего получать мутации, связанные с заменой одной единственной аминокислоты в структуре фермента. В то же время молекулярные механизмы сопряжения двух физически дистанцированных процессов - транспорта протонов и синтеза АТФ – остаются пока неясными.