4.3.3. Комплекс II – сукцинат-убихинон-оксидоредуктаза восстанавливает убихинон при окислении сукцината до фумарата.

Комплекс II, или сукцинатдегидрогеназный комплекс функционирует как часть ЦТК и как компонент дыхательной цепи. Комплекс был выделен из митохондрий картофеля, батата, маша, а также из объектов животного происхождения и бактерий. Его кристаллическая структура была определена у ряда бактерий. Комплекс (М.В.~125 кДа) состоит из четырех крупных полипептидов (А,В,С,иД), кодируемых ядерным геномом (рис.4.16). Субъединицы С и Д – трансмембранные белки, а А и В – представляют гидрофильную часть, обращенную в матрикс. С основной частью могут быть также ассоциированы мелкие гидрофобные белки, функции которых остаются неизвестными.

Редокс-центрами комплекса являются ФАД и три железо-серных центра: 2Fe-2S-, 4Fe-4S- и 3Fe-4S кластеры. Кроме того, в комплексе обнаружен гем b-типа (цитохром b₅₆₀), который не участвует в электронном транспорте, и функция которого неясна. Специфическими ингибиторами комплекса II являются щавелевоуксусная кислота и структурный аналог сукцината – малонат.

Комплекс окисляет сукцинат (Е ₀^/= +0,025 В) до фумарата, и восстанавливает убихинон (Е^/₀= +0,09В):

Сукцинат + Q фумарат + QH₂

Электроны, отнимаемые от сукцината, переносятся сначала на ФАД, а затем через Fe-S-кластеры на Q. Электронный транспорт в комплексе не сопровождается генерацией ⁺. Образующиеся при окислении сукцината 2Н⁺ остаются на той же стороне мембраны, т.е. в матриксе, и затем поглощаются при восстановлении хинона. Таким образом, комплекс II не вносит вклад в энергезацию мембраны и работает только как переносчик еˉ от сукцината к убихинону.

4.3.4. Комплекс III, или цитохром bc₁ комплекс – убихинол-цитохром с оксидоредуктаза - окисляет QH₂ и восстанавливает цитохром c. Электронный транспорт в комплексе сопряжен с генерацией Н⁺.

Комплекс III выделен из митохондрий сердца быка, цыпленка, кролика и митохондрий дрожжей. В состав комплекса из митохондрий сердца быка (М.B. ~248 кДа) входит порядка 11 белковых субъединиц, восемь из которых представляют собой мелкие гидрофобные мембранные белки с неизвестной (возможно, структурной) функцией. Известно, что комплекс образует в целом 13 белковых петель, пересекающих мембрану. Из всех белков комплекса только цитохром b кодируется митохондриальным геномом.

Функциональными компонентами комплекса, несущими редокс-центры, являются:

-цитохром b, в составе которого есть два гема b-типа с разными редокс-потенциалами: гем b_L (b₅₆₆) с низким (Е₀^/  -0,075 –0,09 В) и гем b_H (b₅₆₂₎ с высоким (Е ₀^/ + 0,05В) потенциалом;

- железо-серный белок Риске в составе которого есть 2Fe-2S центр (Е ₀^/ + 0,29В);

-цитохром с₁, (Е₀^/ =+0,23В);

-центры связывания для убихинона: Q_i -центр и Q_o- центр .

Известно, что in vivo комплекс функционирует как димер. Ингибитором комплекса является антибиотик антимицин А, который связывается и блокирует Q_in-центр. Кроме того, места связывания хинонов блокируются антибиотиками, получаемыми из миксобактерий, – миксотиазолом и стигмателлином.

Цитохром bс₁ комплекс окисляет восстановленный убихинон и восстанавливает цитохром с (Е^/₀= +0,25В) согласно уравнению:

Q H₂ + 2 цит с⁺³ + 2Н⁺_in Q +2 цит с⁺² + 4H⁺_out

Электронный транспорт в комплексе сопряжен с переносом протонов из матрикса ( in) в межмембранное пространство (out) и генерацией на мембране Н⁺.События, которые при этом происходят, известны как Q- цикл, который был постулирован П.Митчеллом (1976). Принцип Q-цикла состоит в том, что перенос Н⁺ через мембрану происходит в результате окисления и восстановления хинонов на самом комплексе. При этом хиноны соответственно отдают и забирают 2Н⁺ из водной фазы избирательно с разных сторон мембраны (рис.4.17 А и В).

В структуре комплекса III есть два центра, или два «кармана», в которых могут связываться хиноны. Один из них, Q_o - центр, расположен между 2Fe-2S-центром и гемом b_L вблизи внешней (out) стороны мембраны, обращенной в межмембранное пространство. В этом кармане связывается восстановленный QH₂. Другой, Q_i -карман, предназначен для связывания окисленного убихинона (Q) и расположен вблизи внутренней( in) стороны мембраны, контактирующей с матриксом. Транспорт электрона в комплексе организован следующим образом. Сначала первый QH₂ связывается и окисляется в Q_o- центре, освобождая при этом 2Н⁺ в межмембранное пространство. При этом один e‾ уходит на 2Fe-2S –центр белка Риске и далее на цитохром с₁ и цитохром с (рис.4.17А) В результате в Q_o- центре остается свободный анион радикал - семихинон Q^.ˉ. В Q_o – центре Q^.ˉׂ крайне нестабилен и быстро отдает второй электрон на гем b_L и далее на гем b_H. Расположение этих гемов в комплексе перпендикулярно плоскости мембраны, в результате чего электрон пересекает мембрану в направлении к Q _{in –} центру. В этом “кармане” уже связан окисленный Q, который принимает один e‾ с гема b_H и восстанавливается до семихинона (Q^.ˉ), состояние которого здесь является более стабильным. Затем все эти события повторяются при окислении второго QH₂ (рис.4.17Б) Опять один e‾ уходит на 2Fe-2S- центр и далее на цитохромы с₁ и с, а второй e‾ передается через два гема в Q _in -карман. Здесь его дожидается семихинон Q^.ˉ, который принимает второй электрон иׂ полностью восстанавливается до QH₂ , захватывая 2Н⁺ из матрикса. Восстановленный таким образом QH₂ покидает Q_in -центр, уходит в мембранный пул и может быть вновь окислен в Q_о- центре комплекса. Таким образом, при окислении двух QH₂ в Q_o-центре, каждый раз 2Н⁺ уходят в межмембранное пространство. Из 4 e‾ , отданных в комплекс, 2 e‾ идут на восстановление цитохрома с, т.е. уходят по цепи, а два других последовательно восстанавливают Q до QH₂ в Q_in -центре, что сопровождается захватом из матрикса еще 2Н⁺. Если мы напишем общее уравнение, а потом его сократим, то получим выражение, приведенное выше:

2QH₂ + 2 цит c³⁺ +2H⁺_in + Q = 2 Q + QH₂ + 2 цит c²⁺ + 4H⁺ _out или

QH₂ + cyt c³⁺ + 2H⁺_{in =} Q+ 2 cyt c²⁺ +4H⁺_out

В итоге на каждый е^-, уходящий по цепи, 2Н⁺ переносятся из матрикса в межмембранное пространство (2ē/4Н⁺).

Необходимым и парадоксальным условием работы Q - цикла является тот факт, что время жизни и состояние семихинонов в двух центрах связывания разное. В Q₀-центре Q·ˉׂ нестабилен и действует как сильный восстановитель, способный отдать e‾ на низкопотенциальный гем b_L. В Q_in –центре образуется относительно долгоживущий Q·ˉ, потенциал которого позволяет ему действовать в качестве окислителя, принимая электроны с гема b_H. Еще один ключевой момент Q-цикла связан с расхождением двух электронов, входящих в комплекс, по двум разным путям. Механизм такой транспортной “развязки” интригует исследователей. Изучение кристаллической структуры комплекса показало, что позиция 2Fe-2S-центра относительно других редокс-центров может смещаться. Оказалось, что белок Риске имеет подвижный домен, на котором собственно и расположен 2Fe-2S-центр. Принимая e‾ и восстанавливаясь 2Fe-2S центр меняет свое положение, отдаляясь от Q₀-центра и гема b_L на 16,4 Ǻ (21,2 Ǻ ) и тем самым приближаясь к цитохрому с₁. Отдав электрон цитохрому, 2Fe-2S-центр, наоборот, сближается с Q_о–центром для установления более тесного контакта. Таким образом, функционирует своеобразный шаттл, челнок, гарантирующий уход второго электрона на гемы b_L и b_H . Пока это единственный пример, когда электронный транспорт в комплексах связан с подвижным доменом в структуре белка.

Данные ренгеноструктурного анализа, позволяющие определить положение активных групп относительно друг друга, дают основание думать, что электронный транспорт возможен не только между двумя гемами комплекса, но и между двумя гемами b_L, расположенными на разных комплексах, ассоциированных в димер.

Комплекс III – полифункционален. Недавние исследования на митохондриях пшеницы, картофеля и шпината показали, что одна (две) из субъединиц комплекса, обращенных в матрикс обладает МРР-пептидазной активностью и принимают участие в транспорте белков в митохондрии (см. 4. 3.11).

Следует сказать, что среди комплексов, способных генерировать Н⁺, комплекс III является наиболее универсальным. Он присутствует не только в митохондриальной мембране, но и в мембранах хлоропластов и хроматофоров. В ЭТЦ фотосинтеза функционирует цитохром b₆f комплекс, аналогичный цитохром bc₁ комплексу дыхательной цепи.

Итогом сложной работы комплекса III является восстановление цитохрома с. Цитохром с – это небольшой ( М.В.~12,5 кДа ) белок, единственный белок цепи, не интегрированный в мембрану. Цитохром с курсирует вдоль мембраны и переносит по одному e‾ на следующий и последний комплекс дыхательной цепи – цитохромоксидазу.

4.3.5. Комплекс IV, или цитохромоксидаза – цитохром с - кислород- оксидоредуктаза – окисляет цитохром с и восстанавливает О₂ до воды. Электронный транспорт в комплексе сопряжен с генерацией Н⁺.

Комплекса IV, или цитохромоксидаза, был выделен и изучен на таких объектах как митохондрии сердца быка и мембраны бактерии Paracoccus denitrificans. Комплекс из митохондрий быка (М.В.~125 кДа) состоит из 13 белковых субъединиц. Три большие трансмембранные субъединицы кодируются митохондриальной ДНК, и окружены 9-10 более мелкими, синтез которых контролируется ядерными генами.

Редокс–центры комплекса расположены на двух крупных субъединицах I и II, интегрально встроенных в мембрану (рис.4.18). На субъединице II расположен CuА -центр, в составе которого есть два атома меди, лигандами которых являются остатки гистидина, метионина, глутамата и цистеина. Несмотря на присутствие двух атомов меди, CuА-центр функционирует как одноэлектронный переносчик, при этом медь меняет свою валентность Cu²⁺↔Сu¹⁺ . Известно, что субъединица I образует 12 трансмембранных петли и содержит три редокс-центра: гем а и так называемый биядерный центр гема₃-CuB, в состав которого входит гем а₃ и атом меди. Атом Fe в составе гема а₃ и атом Cu связаны с остатками гистидина в структуре белка. Кроме того, недавно в комплексе обнаружены ион Mg²⁺ и Zn²⁺. Известно, что комплекс IV проявляет наибольшую активность в форме димера. Классическими ингибиторами комплекса является цианид, азид и СО.

Комплекс IV последовательно окисляет 4 цитохрома с (Е^/₀= +0,25В) и, принимая 4e‾, восстанавливает О₂ до Н₂О (Е^/₀= +0,82В). Электронный транспорт сопряжен с генерацией на мембране Н⁺. Два различных механизма вносят вклад в образование Н⁺: при восстановлении О₂ четыре Н⁺ захватываются из матрикса для образования 2 молекул Н₂О и еще 4Н⁺ активно перекачиваются из матрикса в межмембранное пространство, пересекая через комплекс мембрану.

4 цит c²⁺ +4H⁺_in +4H⁺_in +O₂ = 2H₂O + 4H⁺_out + 4 цит c³⁺

Путь электрона в комплексе известен. Цитохром с связывается на субъединице II и восстанавливает CuA-центр, расположенный вблизи поверхности мембраны. С CuA-центра e‾ уходит на гем а, и далее на биядерный центр гем а₃–СuВ, расположенные в толще мембраны. В биядерном центре происходит связывания О₂ и его восстановление до Н₂О. Необходимые для этого 4e‾, видимо, накаливаются в биядерном центре. Механизм восстановления кислорода уже давно является предметом интенсивного изучения, но все же ясен не до конца.

Помимо того, что комплекс IV захватывает из матрикса 4Н⁺ для образования двух молекул воды, он еще работает как протонная помпа, перекачивая 1Н ⁺ из матрикса наружу на каждый электрон, входящий в комплекс (4е‾/4Н⁺). Механизм захвата и трнслокации ионов Н⁺ точно не установлен. Ренгеноструктурный анализ, а также данные, полученные с помощью метода точечного мутагенеза, выявили в структуре субъединицы I пути, по которым протоны могут проникать и пересекать через комплекс мембрану. Эти пути получили название D, K и H- каналов. В каналах, выстланные полярными аминокислотными остатками, по-видимому, удерживаются молекулы воды. Обнаруженный недавно в комплексе ион Mg²⁺ , возможно, как раз и нужен для стабилизации этих молекул. Предполагается, что К-канал связывает водную фазу матрикса с биядерным центром и служит для доставки «субстратных» протонов, необходимых при образовании воды. D-канал, по-видимому, формирует сквозной путь и по нему могут проходить как «субстратные» протоны, так и протоны, перекачиваемые через мембрану. У эукариот обнаружен еще Н-канал, который, вероятно, также является сквозным. Несмотря на то, что молекулярная структура комплекса IV достаточно полно расшифрована, механизм его работы остается непонятным. Известно, что в комплексе идет встречное движение электронов и протонов. Однако остается загадкой, как взаимосвязаны эти два процесса, где и как электронный транспорт сопрягается с движением ионов Н⁺, пересекающих комплекс. Данные, полученные методом точечного мутагенеза, доказывают, что активную роль в этом играют конкретные аминокислотные остатки, мутации по которым блокируют те или иные стадии в работе комплекса. Речь идет прежде всего об остатках гистидина-284 и тирозина-288, расположенных вблизи биядерного центра, а также остатках лизина -362, глутамата -286 и аспарагина-132, играющих ключевую роль в функционировании каналов.

4.3.6. Электронный транспорт в дыхательной цепи сопряжен с генерацией Н⁺ и синтезом АТФ из АДФ и Фн.

С точки зрения термодинамики транспорт двух электронов по градиенту потенциала от НАДН (Е₀^/= -0, 32 В) к кислороду (Е₀^/ = +0,82В) сопровождается отрицательным изменением стандартной свободной энергии, величина которого может быть рассчитана по формуле G^/₀ =-nFE^/₀ и составляет -52,7 ккал (см. «биоэнергетика»). Освобождаемая свободная энергия используется для синтеза АТФ из АДФ и Фн. Известно, что для этой реакции необходимо около 11-13 ккал, так что теоретически окисление НАДН может быть сопряжено с синтезом как минимум трех молекул АТФ. Возникает вопрос, а сколько молекул АТФ образуется реально? В начале 50-тых годов были проведены опыты по определению коэффициента Р/О, равного числу молекул ортофосфата, используемого для фосфорилирования АДФ в расчете на каждый атом поглощенного кислорода. Оказалось, что отношение Р/О зависит от природы окисляемого субстрата и при окислении НАДН может приближаться к трем (2,5-2,7), а при окислении сукцината - к двум (1,5-1,8). Отсюда возникло представление, основанное также на величинах перепада свободной энергии на разных участках цепи, что в самой дыхательной цепи существуют три места, или пункта сопряжения, где происходит синтез АТФ. Транспорт e‾ может идти через 3 или 2 пункта сопряжения и сопровождаться соответственно синтезом трех или двух молекул АТФ. Теперь мы знаем, что это представления оказались не совсем верными: синтез АТФ происходит не в дыхательной цепи. Работа цепи состоит лишь в перекачке через мембрану протонов для образования Н⁺, который необходим для работы АТФ-синтазы. Однако исследователи продолжают использовать термин «пункты сопряжения», но теперь под ними подразумевают те участки цепи, на которых возникает Н⁺, т.е. комплексы I, III и IV. Если при окислении НАДН электроны идут по полной цепи, т.е. через три пункта сопряжения, величина генерируемого Н⁺ будет максимальной. Окисление сукцината на комплексе II сопряжено с транспортом e‾ только через два пункта сопряжения. В итоге величина генерируемого цепью Н⁺ будет меньше, и меньше будет число синтезируемых молекул АТФ. У растений альтернативный путь дыхания через АО потенциально имеет только один пункт сопряжения (это комплекс I) и диссипирует большую часть энергии в тепло. Следовательно, в зависимости от преобладания того или иного пути окисления субстрата in vivo величина Н⁺, а значит и число синтезируемых молекул АТФ, будет варьировать.

Итак, работа трех протонных помп в цепи приводит к неравномерному распределению протонов по обе стороны мембраны и ее энергезации*. Возникающий на мембране электрохимический протонный градиент Н⁺, который может быть также представлен как протондвижущая сила , имеет две составляющие:

Н⁺ /F = =-59 рН (мВ) .

Из-за «дырявости» наружной мембраны митохондрий рН в межмембранном пространстве такой же, как и в цитозоле. Поэтому градиент рН складывается небольшой ( рН=0,2-0,5) и не вносит существенно вклада в величину . Основной вклад вносит электрическая составляющая, мембранный потенциал . В результате концентрации ионов Н⁺ на внешней, а ионов ОН^- на внутренней поверхности, одна сторона мембраны заряжается более положительно, а другая – более отрицательно. Возникающий заряд способствует концентрации по обе стороны мембраны и других ионов: любой отрицательный ион будет стремиться покинуть, а положительный – вернуться в матрикс, что усиливает составляющую мембранного потенциала. На мембране растительных митохондрий  обычно составляет -150-200 мВ.

Величина Н⁺, или протондвижущей силы , является мерой свободной энергии, запасенной в трансмембранной разности электрохимических потенциалов иона Н⁺. Эта энергия может быть реализована в результате движения протонов в обратном направлении по градиенту электрохимического потенциала. АТФ-синтаза сопрягает диффузию протонов обратно в матрикс с синтезом АТФ Обратный ток протонов через F₀-канал приводит в движение АТФ-синтазные комплексы, катализирующие синтез АТФ из АДФ и Фн.

Следовательно, работа АТФ-синтаз приводит к уменьшению, или диссипации Н⁺ и разрядке мембраны. Подробно процесс синтеза АТФ при работе АТФ-синтазных комплексов рассмотрен в разделе «биоэнергетика».

Во внутренней мембране митохондрий локализована F₀F₁АТФ-синтаза (F₀F₁-АТФаза), ориентированная своей каталитической частью (F₁-фактор) в матрикс (рис.4.14.). В отличие от СF₀СF₁-АТФазы хлоропластов, митохондриальные АТФ-синтазы проявляет высокую чувствительность к антибиотику олигомицину, который блокирует транспорт Н⁺ через F₀ канал и тем самым запрещает синтез АТФ. Общее число протонов, переносимых через мембрану при работе дыхательной цепи в принципе точно не установлено, т.к. точно не установлен механизм их транслокации на комплексах I и IV. Считают, что это число равно как минимум 10 Н⁺ на каждые 2e‾ , переносимых от НАДН на О₂ по полной цепи (рис.4.14 и 4.20). Если считать, что данный процесс может привести к синтезу трех молекул АТФ, то тогда для синтеза одной может быть достаточно 3Н⁺, проходящих через F₀-канал. Однако эти расчеты не принимают во внимание побочные затраты, также связанные с использованием Н⁺. Например, транспорт в матрикс фосфата (который необходим для синтеза АТФ) идет в симпорте, т.е. совместно с Н⁺ и, следовательно, связан с определенной диссипацией протонного градиента (см. 4. 3.11).

4.3.7. Скорость электронного транспорта контролируется Н⁺ на мембране и зависит от содержания АДФ и Фн. Дыхательный контроль.

Скорость электронного транспорта обычно измеряют по скорости поглощения О₂ суспензией митохондрий при наличии субстрата дыхания, например НАДН или сукцината.

Если митохондрии удалось выделить без существенного повреждения мембран, то ско- рость поглощения О₂ будет четко зависеть от присутствия в реакционной среде АДФ (рис.4.19). Если в среде содержится фосфат, то добавление АДФ даже в незначительной концентрации сразу же доводит скорость поглощения О₂ до максимальной, которая остается таковой до тех пор, пока весь АДФ не превратится в АТФ. Тогда скорость дыхания падает вплоть до 10-15% от максимальной и может опять возрасти при внесении АДФ. Этот экспериментальный факт получил название дыхательного контроля.

Каков же механизм лежит в основе дыхательного контроля? В нормально функционирующих митохондриях электронный транспорт сопряжен с синтезом АТФ. При сопряженном транспорте дыхательная цепь работает на создание Н⁺, работающие АТФ-синтазы рассеиваютН⁺, и оба процесса находятся в динамическом равновесии (рис.4.20.).

При наличии АДФ и фосфата АТФ-синтазы функционируют бесперебойно, но если возникнет дефицит АДФ, их работа будет блокирована из-за недостатка субстрата. Это значит, что прекратиться обратный ток протонов в матрикс через F_0-канал, и величина Н⁺ начнет расти. При достаточно высоких значениях Н⁺ неизбежно возникнут трудности в работе трех протонных помп в цепи, что автоматически приведет к торможению электронного транспорта. Если в эксперименте создать очень высокий градиент Н⁺, то электронный транспорт может вообще прекратиться. Если в систему вновь добавить АДФ, и тем самым активировать АТФ-синтазы, то величина Н⁺ снизится, и скорость электронного транспорта вновь возрастет.

*Энергезация мебраны сопровождается изменением ее свойств. В энергезованном состоянии мембрана становится визуально тоньше. Давно замечено, что в условиях активного дыхания митохондрии становятся более компактными, а при подавлении дыхания - разбухают.

Таким образом, механизм дыхательного контроля основан на прямом ингибирующем влиянии Н⁺ на электронный транспорт. Отсюда следует важный вывод: in vivo скорость переноса электрона в цепи прямо зависит от работы АТФ-синтаз, а значит от соотношения АТФ/АДФ в матриксе. В свою очередь это соотношение определяется скоростью расхода АТФ в клетке и отражает ее энергетический статус.

Таким образом, дыхательный контроль - это часть уже рассмотренной нами фундаментальной системы регуляции дыхания через содержание АТФ и АДФ. Эта система контролирует скорость окисления глюкозы, начиная с гликолиза, ЦТК, и кончая электронным транспортом в дыхательной цепи.

Следует отметить, что в литературе обсуждается «второй» механизм дыхательного контроля. Некоторые экспериментальные факты, полученные при работе с митохондриями животных, указывают, что на комплексе IV есть сайты (расположенные на одной из обращенных в матрикс субъединиц), в которых прямо могут связываться АТФ и АДФ. Предполагается, что связываясь с комплексом, АТФ его ингибирует, а АДФ вытесняет АТФ из сайтов связывания. Таким образом, возможно, существует еще одна возможность контролировать скорость дыхания: при высоком соотношении АТФ/АДФ в матриксе АТФ аллостерически ингибирует активность цитохромоксидазы.

4.3.8. Разобщенный электронный транспорт не приводит к образованию Н⁺ и синтезу АТФ. Разобщение имеет место in vivo в митохондриях растений и животных.

Электронный транспорт в дыхательной цепи может быть не только сопряженным, но и разобщенным. Мы знаем, что непременным условием создания и поддержания Н⁺ является непроницаемость сопрягающей мембраны для ионов. Разобщение – это моментальная диссипация создаваемого цепью Н⁺ в результате увеличения протонной проницаемости мембраны. Впервые явление разобщения электронного транспорта с фосфорилированием было показано при изучении соединений, которые впоследствии стали называть разобщителями*. Разобщители делают мембрану проницаемой для Н⁺ или других ионов, а значит либо полностью снимают Н⁺, либо снижают его величину (рис.4.20.). В присутствии разобщителей цепь работает вхолостую: перекачка протонов через мембрану не приводит к созданию Н⁺, т. к. ионы быстро возвращаются обратно. В этих условиях АТФ-синтазы прекращают работу, а электронный транспорт идет с максимальной скоростью из-за отсутствия «сдерживания» со стороны Н⁺ . В этом случае электронный транспорт разобщен с синтезом АТФ и называется разобщенным.

Разобщители разных типов представляют собой чрезвычайно удобный инструмент для исследования энергетики мембран. Благодаря их специфичности можно избирательно влиять на две составляющие Н⁺ -  рН и мембранный потенциал. Как правило, разобщителями являются небольшие гидрофобные молекулы, легко растворимые в липидном бислое. Некоторые из них, например антибиотики грамицидин, нонактин, аламетицин, встраиваются в липидный бислой и формируют каналы, по которым ионы Н⁺ и К⁺ и Na⁺ могут свободно проходить мембрану. Другой случай, когда разобщители (ионофоры) образуют с ионом подвижный комплекс. Например, антибиотик валиномицин связывает ион К⁺ координационными связями в центре молекулы и в таком виде пересекает митохондриальную мембрану, двигаясь по градиенту заря-

*действие разобщителей, увеличивающих проницаемость биологических мембран для Н⁺, в свое время послужило убедительным доказательством правоты хемиосмотической теории П.Митчелла.

да в более отрицательную область. Перенос положительно заряженного К⁺ снимает на мембране заряд, т.е. составляющую , не влияя на величину рН. Наоборот, протонофоры, будучи слабыми гидрофобными кислотами, пересекают мембрану в протонированной форме и снимают градиент рН. К числу протонофоров относятся такие широко используемые разобщители как 2,4 динитрофенол, нигерицин, моненсин, FССР (карбонилцианид-n-трифторметоксифенилгидразон). Следует также отметить, что сопряжение электронного транспорта с фосфорилированием легко нарушается в процессе выделения митохондрий, особенно из растительных объектов. Из-за жестких клеточных стенок гомогенизация растительного материала часто сопровождается повреждением митохондриальных мембран, в результате чего транспорт становится разобщенным.

Однако не надо думать, что разобщение представляет собой частный случай, наблюдаемый в эксперименте. Разобщение электронного транспорта с синтезом АТФ играет важную роль в метаболизме как животных, так растений. Дело в том, что помимо запасания энергии в конвертируемой форме Н⁺ и АТФ, одной из важных функций клеточного дыхания является рассеивание энергии в виде тепла. У животных разобщение – это один из способов повышения температуры тела. В митохондриях бурого жира (особая ткань млекопитающих, вырабатывающая дополнительное тепло при охлаждении) энергия Н⁺ может использоваться не на синтез АТФ, а рассеиваться в виде тепла. Рассеивание Н⁺ происходит в результате повышения протонной проводимости мембраны на фоне резкого увеличения содержания в клетке свободных жирных кислот, образующихся при гидролизе жиров. Свободные жирные кислоты представляют собой природные протонофоры: циркулируя через мембрану, они способны оказывать разобщающее действие. Это выглядит так: анион жирной кислоты (пальмитиновой, линолевой олеиновой) связывает ион Н⁺ на внешней поверхности мембраны и пересекает ее в протонированной форме, двигаясь по градиенту рН (рис.3.9.) На внутренней стороне мембраны наступает обратная диссоциация. Однако, чтобы система работала, необходимо вернуть анион жирной кислоты обратно. И здесь в процесс включаются специальные белки-переносчики, при помощи которых анион жирной кислоты диффундирует через мембрану в обратном направлении, двигаясь уже по градиенту заряда. Во внутренней мембране митохондрий бурого жира и других тканей млекопитающих обнаружено семейство так называемых разобщающих UCP (unсouple protein)-белков, выполняющих именно эту функцию (рис.4.20 и 4.21). Не так давно стало ясно, что разобщение электронного транспорта с фосфорилированием имеет место in vivo и у растений. Растительные митохондрии содержат аналоги UCP-белков. Так, UCP5 –белок обнаружен в митохондриях картофеля и арабидопсиса. У арабидопсиса показано наличие нескольких ядерных генов, кодирующих изоформы UCP5 –белка, экспрессия которых стимулировалась на холоду. Таким образом, растения, как и животные, с помощью жирных кислот и UCР-белков способны ликвидировать Н⁺, освобождая энергию в виде тепла.

Если животные через разобщение могут значительно повысить температуру тела, то растения к этому не способны. Физиологическая функция разобщения в растительном метаболизме связана, видимо, только с регуляцией электронного транспорта. Иногда на фоне избытка нереализованного АТФ необходимо быстро окислить НАДН в дыхательной цепи, чтобы поддержать работу ЦТК. Для этого необходимо увеличить скорость электронного транспорта, который заторможен под действием высоких значений Н⁺. Снизив величину Н⁺ на мембране через механизм разобщения, можно увеличить скорость электронного транспорта даже при высоком соотношении АТФ/АДФ в матриксе, т.е. «обмануть» систему дыхательного контроля.

Функцией разобщения может быть также защита от окислительного стресса. Дело в том, что при работе комплексов I, II и III часть электронов сбрасывается на кислород. Даже в норме в цепи идет прямое одноэлектронное восстановление О₂ с образованием супероксидрадикала О₂^.-(.4..4.1.). В свою очередь О₂^.- быстро нейтрализуется супероксиддисмутазой с образованием более стабильного продукта – перекиси водорода: 2О₂·‾ + 2Н⁺ = Н₂О₂.

Супероксидрадикал и Н₂О₂ представляют опасность для клетки, т.к. обладают большой окислительной способностью.В то же время угроза их накопления в клетке вполне реальна, особенно при насыщении цепи электронами. При высоком Н⁺ торможение электронного транспорта, что способствует перевосстановлению редокс-центров цепи, электроны с которых начинают интенсивно сбрасываться на кислород. В этих условиях можно снизить интенсивность образования супероксидрадикала, если увеличить скорость транспорта и разгрузить цепь через разобщение. Данный вывод подтвержден экспериментально. Так, ингибирование UCP-белка в митохондриях клубней картофеля сопровождалось чрезмерным накоплением Н₂О₂. И, наоборот, при активации разобщения жирными кислотами уровень этого опасного соединения в клетке был низким.